论文总字数：27728字

摘 要

Alloferons是从丽蝇Calliphora vicina的细菌攻击幼虫中分离出来的一种新型抗生肽。根据各种研究实验，已经证明它可以增加自然杀伤细胞活性，在人体内诱导各种选择性细胞因子合成，并且它还被证明具有广泛的抗病毒，抗癌，抗炎和通过免疫调节活动产生抗过敏作用。聚乙二醇是一种水溶性的高分子聚合物，对人体无毒副作用。聚乙二醇修饰可增强药物的水溶性、降低药物毒副作用、延长其半衰期、减低蛋白酶的水解、提高药物稳定性等。因此，近年来，蛋白质的聚乙二醇修饰技术在生物化学领域得到广泛应用。本文概述了Alloferon结构及其氨基酸组合规律，并通过固相合成法将Alloferon进行PEG修饰，试图找到活性更好的化合物。

关键词：抗病毒肽 聚乙二醇 蛋白质修饰

Structural Simulation and Pegylation of Alloferon Derivatives

Abstract

Alloferons is a new antibiotic peptide isolated from the larvae attacked by Calliphora vicina. According to various different research experiments, it has been proved that it can increase the activity of natural killer cells, induce the synthesis of various selective cytokines in human body, and it has also been proved to have a wide range of anti-viral, anti-cancer, anti-inflammatory and anti-allergic effects through immune regulation activities. Polyethylene glycol (PEG) is a water- soluble polymer with no toxic side effects on human body. Polyethylene glycol modification can improve the water solubility of protein drugs, reduce drug toxicity and side effects, prolong their half-life, reduce the hydrolysis of protease, and improve drug stability. Therefore, polyethylene glycol modification of proteins has been widely used in the field of biochemistry. In this paper, the structure of Alloferon and its amino acid combination were summarized. Alloferon was modified with PEG by solid-phase synthesis, in order to find compounds with better activity.

Key words: antiviral peptide; polyethylene glycol; protein modification

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 Alloferon 1

1.1.1 Alloferon介绍 1

1.1.2 Alloferon的抗哮喘性 1

1.1.3 Alloferon 的抗病毒活性 2

1.1.4 Alloferon 的抗肿瘤活性 3

1.1.5 Alloferon及其衍生物的研究 3

1.1.6 Alloferon的合成及改造 4

1.1.7 Alloferon 在临床上的应用展望 5

1.2 PEG的修饰 5

1.2.1 PEG理化性质 5

1.2.2 聚乙二醇的化学性质 6

1.2.3 PEG修饰方法 7

1.3固相合成法 9

1.3.1 固相合成介绍 9

1.3.2 通用合成路线 9

1.3.3 与液相合成比较 10

1.4 本课题的研究意义 10

第二章 Alloferon的PEG修饰实验 11

2.1 前言 11

2.2 实验仪器及试剂 11

2.2.1 实验仪器 11

2.2.2 实验试剂 11

2.3 Alloferon的合成 13

2.3.1 合成简易流程 13

2.3.2 Alloferon 的制备 13

2.3.3 Alloferon的纯化 14

2.3.4 PEG与Alloferon结合 15

2.3.5 Alloferon-PEG的纯化 15

2.3.6 高效液相色谱分析 15

2.2.7 质谱分析 16

第三章 结果和讨论 17

3.1 高效液相色谱(HPLC)和质谱(MASS)结果 17

3.1.1 Alloferon谱图结果 17

3.1.2 MiniPEG-Alloferon谱图结果 18

3.1.3 PEG3-Alloferon谱图结果 20

3.1.4 PEG4-Alloferon谱图结果 21

3.2 数据分析 23

3.3 讨论 23

第四章 总结与展望 26

4.1 总结 26

4.2 展望 26

参考文献 27

致谢 31

文献综述

1.1 Alloferon

1.1.1 Alloferon介绍

Alloferon是从苍蝇Calliphora vicina的细菌攻击幼虫中分离出来的一种抗病毒肽^[1]。该物种与其他外科蛆一样，在伤口愈合和溃疡愈合方面有着悠久的医疗历史。在对细菌进行实验性攻击后，Calliphora vicina也会产生一系列有效的抗菌物质，其主要结构与其他昆虫相似，即昆虫防御素，二蝶呤，天蚕素和富含脯氨酸的肽。2002年Sergey Chernysh^[1]等对Calliphora vicina血淋巴的酸性提取物进行HPLC纯化，并使用小鼠脾淋巴细胞的细胞毒性来监测生物活性。在大量纯化后，分离出13和12个氨基酸的两个肽，鉴定它们的氨基酸序列分别为HIS-GLY-VAL-SER-GLY-HIS-GLY-GLN-HIS-GLY-VAL-HIS-GLY（Alloferon -1）和GLY-VAL-SER-GLY-HIS-GLY-GLN-HIS-GLY-VAL-HIS-GLY（Alloferon-2）。现有的对Alloferon的研究大多是针对有十三个氨基酸的Alloferon 1，Alloferon 1的分子量为1264.29000，分子式为C₅₂H₇₅N₂₂O₁₆，其结构式如图1-1。

图1-1 Alloferon结构式

1.1.2 Alloferon的抗哮喘性

哮喘是一种众所周知的炎症性肺病，但是，具体的潜在机制在很大程度上是未知的，以前有证明Alloferon能有效地下调肺部炎症。 Alloferon可与泼尼松龙（PDA）协同降低中性粒细胞的数量。通过单独的Alloferon和与Alloferon和PDS的联合治疗有效地预防了细支气管周围和OVA诱导的哮喘小鼠的肺泡中的炎性细胞浸润。单独的Alloferon和与Alloferon和PDS的联合治疗降低了IL-5和IL-17的产生。全氟化物给药后总免疫球蛋白（Ig）水平无变化;然而，PDS降低了总Ig。单独的Alloferon或与PDS组合的Alloferon均未改变IgG2a水平。然而，Alloferon和PDS降低了OVA特异性IgG1和IgE的水平。总之，我们的研究结果表明，Alloferon和泼尼松龙的组合可有效治疗哮喘，因为它通过下调IL-5和IL-17的产生来预防炎症细胞浸润，并通过抑制T来降低IgG1和IgE的产生。辅助2型免疫反应。^[2]

1.1.3 Alloferon 的抗病毒活性

Alloferon是一种免疫调节肽，对疱疹病毒具有抗病毒作用。^[3]Lee等^[4]通过对裂解周期相关病毒基因（RTA、K8和VIRF2）的下调，Alloferon有效地恢复了TPA对BCBL-1的抑制增殖。为了阐明Alloferon调控病毒基因的信号转导途径，在抑制erk磷酸化和tpa激活ap-1之前，Alloferon明显抑制了钙进入BCBL-1。此外，当NK细胞暴露于Alloferon时，它们的细胞溶解活性得到了提高，这是通过增强穿孔素/颗粒酶分泌来介导的。研究结果表明，在通过下调AP-1活性来调节KSHV的生命周期和通过上调NK细胞的细胞毒性来增强抗病毒免疫力方面，Alloferon可作为一种有效的抗病毒药物。

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