论文总字数：19671字

摘 要

Alloferons是从受细菌感染的丽蝇幼虫中分离出来的一种抗菌肽。它在体外刺激自然杀伤淋巴细胞，并且还在体内促进抗病毒和抗肿瘤能力。 PEG修饰剂，也称为聚乙二醇剂，是具有官能团的聚乙二醇。目前，它主要用于蛋白质药物修饰，以增加药物在人体的半衰期，降低免疫原性，减少蛋白酶的水解，提高稳定性，增加药物的水溶性等，并且对人体无毒。近年来，PEG修饰已广泛用于药物开发，并在药物药效缓释中起重要作用。本文总结了Alloferon的理化性质及其应用，以及通过固相合成对Alloferon进行PEG修饰，以寻找具有更好活性的化合物。

关键词：抗病毒肽 聚乙二醇 蛋白质修饰

Structural Simulation and Pegylation of Alloferon Derivatives

Abstract

Alloferons are antimicrobial peptides isolated from Bacillus larvae infected with bacteria. It stimulates natural killer lymphocytes in vitro and also promotes antiviral and antitumor capabilities in vivo. PEG modifiers, also known as polyethylene glycol modifiers, are polyethylene glycols having functional groups. At present, it is mainly used for protein drug modification to increase the half-life of the human body, reduce the immunogenicity, reduce the hydrolysis of protease, improve the stability, increase the water solubility of the drug, and the like, and is non-toxic to the human body. In recent years, modified PEG has been widely used in drug development and plays an important role in the sustained release of drug efficacy. This paper summarizes the physicochemical properties of Alloferon and its applications, as well as PEG modification of Alloferon by solid phase synthesis to find compounds with better activity.

Key words: antiviral peptide; polyethylene glycol; protein modification

目录

目录

第一章 文献综述 1

1.1 Alloferon 1

1.1.1 Alloferon概述 1

1.1.2 Alloferon的抗炎性 2

1.1.3 Alloferon的抗肿瘤活性 2

1.1.4 Alloferon的抗病毒活性 2

1.1.5 Alloferon抗哮喘性 3

1.1.6 Alloferon及其衍生物的研究 3

1.1.8 Alloferon 在临床上的应用展望 4

1.2 PEG修饰 5

1.3本课题的研究意义 7

第二章Alloferon的PEG修饰实验 1

2.1 前言 1

2.2 实验仪器及试剂 1

2.2.1 实验仪器 1

2.2.2 实验试剂 1

2.3 Alloferon的合成 3

2.3.1 合成简易流程 3

2.3.2 Alloferon 的制备 3

2.3.3 Alloferon的纯化 4

2.3.4 PEG与Alloferon结合 4

2.3.5 Alloferon-PEG的纯化 5

2.3.6 高效液相色谱分析 5

2.3.7 质谱分析表 1

第三章 结果和讨论 1

3.1 高效液相色谱(HPLC)和质谱(MASS)结果 1

3.1.1 Alloferon谱图结果 1

3.1.2 PEG5-Alloferon谱图结果 2

3.1.3 PEG6-Alloferon谱图结果 4

3.2 数据分析 5

3.3 讨论 6

第四章 总结与展望 7

参考文献 8

致谢 11

文献综述

1.1 Alloferon

1.1.1 Alloferon概述

Alloferon（H-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-OH）是一种十三肽，从受细菌感染的丽蝇幼虫中分离出来^[1]。该物种与其他外科蛆一起，在伤口愈合和溃疡愈合方面有着悠久的医疗历史。已知Calliphora在用细菌进行实验性攻击后产生一系列有效的抗微生物物质，其具有与其他昆虫相似的一级结构，即昆虫防御素，二萜，天蚕素和富含脯氨酸的肽^[2]。在Alloferon发现之前的实验指出，Calliphora的粗血淋巴含有当注射到小鼠中时能够刺激抗病毒和抗肿瘤抗性的因子。这种抗性的增强可以反映脾淋巴细胞自然杀伤（NK）活性的显着增加。从实验感染昆虫丽蝇(双翅目)的血液中分离到两种肽段，其氨基酸序列分别为:HGVSGHGQHGVHG (Alloferon 1)和GVSGHGQHGVHG (Alloferon 2)。它们是自然产生的肽，通常由12-13个氨基酸组成。本文只针对Alloferon 1进行探讨及PEG修饰实验描述。Alloferon 1的分子量为1264.29000，分子式为C₅₂H₇₅N₂₂O₁₆，其结构式如图1-1：

图1-1 Alloferon结构式

1.1.2 Alloferon的抗炎性

Alloferon通过调节免疫细胞产生的细胞因子及其活性来显示抗炎作用。研究表明^[3]，在结肠炎中，一种典型的促炎细胞因子IL-6的血浆水平也被Alloferon降低。此外，Alloferon还抑制了TNF-α诱导的结肠癌细胞IκB的降解和磷酸化。实验结果表明，Allofeorn具有抗炎作用，可减轻DSS诱导的结肠炎。Kim等人^[4]研究了Alloferon对uvb 诱导的HaCaT皮肤炎症的影响。实验证明Alloferon能降低uvb诱导的促炎细胞因子，如IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-18在mRNA和蛋白质水平上的产生,Alloferon能抑制UVB照射诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化。此外，局部应用Alloferon对无毛小鼠UVB暴露皮肤的研究表明，Alloferon治疗可显著抑制慢性UVB照射小鼠皮肤上皮厚度的增加。这些研究结果表明，Alloferon不仅对UVB诱导的人角质形成细胞HaCaT炎症有明显的抗炎作用，对小鼠皮肤也有明显的抗炎作用。此外，Alloferon基于降低的疾病活动指数（DAI）和结肠收缩来改善IBD的发病机制，抑制了Colo205结肠癌细胞中TNF-α诱导的IκB降解和磷酸化。总之，这些结果表明，Alloferon具有抗炎作用并减轻DSS诱导的结肠炎。

1.1.3 Alloferon的抗肿瘤活性

NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，可直接清除癌细胞或受感染的宿主细胞。由于NK细胞可以靶向细胞毒性T细胞无法识别的MHC i类阴性细胞，因此它们在病毒感染细胞和癌细胞等自我改变细胞的免疫监测中非常重要^[5]。此外，它们通过产生促进Th1型反应的细胞因子如IFN-γ而促成抗原特异性适应性免疫。NK细胞介导的细胞毒性和细胞因子分泌受多种受体配体相互作用的控制。实验表明，Alloferon通过上调NK激活受体2B4和增强NK细胞的颗粒胞吐作用，具有抗肿瘤作用^[6]。这一研究成果为Alloferon-1作为抗肿瘤新型多肽类药物的研发提供了新的试验依据。临床前研究表明，Alloferon-1对大鼠中枢神经系统无明显的毒性作用^[7]。因此，Alloforon-1在抗肿瘤、抗病毒方面的发展潜力巨大。

1.1.4 Alloferon的抗病毒活性

Alloferon是一种免疫调节肽，对疱疹病毒具有抗病毒作用^[8]。通过对裂解周期相关病毒基因（RTA、K8和VIRF2）的下调，Alloferon有效地恢复了TPA对BCBL-1的抑制增殖^[9]。为了阐明Alloferon调控病毒基因的信号转导途径，在抑制erk磷酸化和tpa激活ap-1之前，Alloferon明显抑制了钙进入BCBL-1。此外，当NK细胞暴露于Alloferon时，它们的细胞溶解活性得到了提高，这是通过增强穿孔素/颗粒酶分泌来介导的。研究表明，在通过下调AP-1活性来调节KSHV的生命周期和通过上调NK细胞的细胞毒性来增强抗病毒免疫力方面。Alloferon可作为一种有效的抗病毒药物。

1.1.5 Alloferon抗哮喘性

虽然哮喘是一种众所周知的炎症性肺病，但具体的潜在机制在很大程度上是未知的。气道重塑引起的气道阻塞和上皮纤维化是哮喘的标志，哮喘治疗通常依赖于皮质类固醇的使用。但是，由于其不良反应，不推荐长期使用皮质类固醇。就哮喘发病过程中诱导的免疫反应而言，已知T辅助2型（Th2）衍生的细胞因子与哮喘的发生和发病机制密切相关。因此，Th2细胞因子，如IL-4，IL-5和IL-13，是哮喘治疗的有用靶点^[10]。Alloferon显著降低了卵蛋白（ova）诱导的哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的数量。实验证明，Alloferon可与泼尼松龙（PDA）协同降低中性粒细胞的数量^[11]。因为它通过下调IL-5和IL-17的产生来防止炎症细胞浸润，通过抑制T辅助因子2型免疫反应来降低IGG1和IgE的产生。

1.1.6 Alloferon及其衍生物的研究

Mariola Kuczer等^[12]将Alloferon位置1的His残基被替换为其他基础氨基酸：（1）碱性脂肪族氨基酸-Lys或-Arg，（2）疏水性脂肪族氨基酸-Ala。此外，还合成了[des-His 1] -alloferon。为了阐明His-1在alloferon及其类似物中的作用，研究了它们对DNA病毒[人类疱疹病毒1型McIntire（HHV-1 MC）和HHV-1临床株的invitro，Vero或HEp-2细胞]和RNA病毒（971 PT Coxsackie B2型和使用HEp-2和LLC-MK2细胞的Coxsackie B2型临床株）抗病毒活性。通过圆二色（CD）光谱分析所有肽的构象偏好。所有肽均未显示出对Vero，LLC-MK2和HEp-2细胞的细胞毒活性。则Alloferon位置1的亲水残基的存在对于抑制病毒复制并不重要。

Agnieszka Kadej 等^[13]在2016年对引入色氨酸残基的Alloferon 1类似物之间的铜（II）络合物形成过程通过电位法、紫外-可见光谱法、CD和EPR光谱法和MS法研究了其残基H1W，H6W，H9W和H12W。对于Alloferon 1的所有类似物，已获得1:1金属-配体摩尔比和2:1 H1W的复合物形态，因为在较高（2:1，3:1和4:1）比率下沉淀。在生理pH 7.4和1:1金属-配体摩尔比下，Alloferon 1的色氨酸类化合物与4 N结合模式形成CuH-1L和/或CuH-2L络合物。研究了在pH 7.4下配体及其铜（II）配合物在黄粉虫细胞体内诱导细胞凋亡。生物学结果表明，体内Cu(II)离子没有引起任何明显的凋亡特征。最活跃的是在pH7.4下形成的H12W肽和Cu(II)-H12W复合物。

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