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摘 要

人参是我国沿用历史悠久的传统中药补药，现代多学科研究发现，人参皂苷是该科植物发挥药效的主要成分, 能够通过多靶点、多途径作用于离子通道受体蛋白及其他信号通路，从而起到抗癌作用。然而野生人参皂苷获取困难，植物酶在微生物体系中难以表达、效率低下，因此我们采用酶法催化人参皂苷底物获取。通过酶分子生物信息比对，挖掘出微生物来源糖基转移酶，运用分子生物学，克隆基因。使其在大肠杆菌中能稳定高效的表达。进行液质分析，对得到的两个产物峰作质谱图验证产物，可基本可以确定，产物一为Rh2，产物二为一个二糖产物。通过进行多重对照试验，将反应条件优化，进一步优化重组菌中糖基转移酶的表达条件。

关键词： 稀有人参皂苷 糖基转移酶 克隆 表达

Enzyme Gene Analysis and Biodirectional Synthesis of Ginsenoside Synthesis

Abstract

Ginseng is a long-established traditional Chinese medicine tonic in China, and modern multidisciplinary studies have found that ginsenosides are the main components of the medicinal effects of this family of plants and can act on ion channel receptor proteins and other signaling pathways through multiple targets and pathways ,play an anti-cancer effect. However, it is difficult to obtain wild ginsenosides, plant enzymes are difficult to express in the microbial system, and the efficiency is low. Therefore, we use enzymatic method to catalyze the acquisition of ginsenoside substrate. Through the comparison of enzyme bioinformatics, the microbial glycosyltransferases were excavated, and molecular biology was used to clone genes. It enables stable and efficient expression in E. coli. The liquid chromatographic analysis was carried out, and the spectrum of the two product peaks obtained was verified by mass spectrometry. It can be basically confirmed that product one is Rh2 and product two is a disaccharide product. By conducting multiple control experiments, the reaction conditions were optimized to further optimize the expression conditions of glycosyltransferases in recombinant bacteria.

Key word: rare ginsenoside ; glycosyltransferase ; clone ; expression

目录

摘 要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1概述 1

1.2稀有人参皂苷合成方法 2

1.2.1化学法 2

1.2.2微生物转化法 2

1.2.3酶法 3

1.3本课题的研究内容和研究意义 3

第二章 枯草芽孢杆菌来源糖基转移酶基因的克隆与表达 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 菌株原料 4

2.1.2 实验培养基和试剂 4

2.1.3 实验设备 5

2.2实验方法 6

2.2.1糖基转移酶基因组的提取 6

2.2.2目的基因糖基转移酶基因的选取及PCR扩增 6

2.2.3回收糖基转移酶基因 7

2.2.4质粒pET-28a( )的提取 8

2.2.5制备并转化大肠杆菌感受态 8

2.2.6 表达体系的构建 8

2.2.7 鉴定菌落是否完成克隆并测序 9

2.2.8 重组菌的表达 9

2.2.9 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 9

2.3 本章小结 10

第三章 酶功能的验证 11

3.1 底物最适吸收波长研究 11

3.2 酶功能的初步探索 11

3.3 产物的验证 12

3.4 反应条件的研究 14

3.4.1 水浴与震荡条件的影响 14

3.4.2 底物比例对反应的影响 16

3.5 其他底物反应测试 16

3.6 本章小结 18

第四章 结语 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

• 1. 概述

人参皂苷是一组三萜皂苷，是人参属植物主要的生物活性成分，其中P. ginseng在亚洲已被用作传统草药数千年^[1]。人参皂苷的化学结构和生物活性已被广泛研究。达玛烷型四环三萜类化合物是主要的人参皂苷成分^[2]。直到现在已有超过110种天然达玛烷型人参皂苷从三七物种中鉴定出来^[3]。根据苷元结构，人参皂苷主要分为两组。一组为原人参二醇（PPD）型皂苷，是通过在PPD的C3-OH或C20-OH处糖基化而生物合成的;另一组是原人参三醇（PPT）型皂苷，是通过在PPT的C6-OH或C20-OH处糖基化而生物合成。这些人参皂苷在抗癌、抗炎、抗氧化和神经保护作用处显示出一系列的生物活性^[4]。加糖的位置，数量和类型的差异导致人参皂苷的生物活性和药用性质的变化。例如，Rg3具有抗癌活性，而Rb1具有对中枢神经系统的影响^[5]。

人参皂苷在C12位还含有羟基，但几乎没有人从人参属中鉴定出C12糖基化的人参皂苷。已经报道出由PPD通过化学半合成产生的C12-糖基化人参皂苷表现出比天然人参皂苷更高的细胞毒性^[6]。然而，化学半合成还面临几个挑战，包括区域选择性，立体选择性以及官能团的保护和去保护。因此，由于化学半合成的复杂性和高成本，大规模生产C12-糖基化人参皂苷是不现实的^[7]，这在药物发现中限制了对这些非人工皂苷的进一步研究。

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