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摘 要

人参皂苷是生活里耳熟能详的中药材人参的主要有效成分，此论文目的在于对人参皂苷糖基转移酶的基因进行分析与克隆。在此次实验中，我们主要采用基因狩猎法，首先在伯克霍尔德菌中获取新型糖基转移酶，然后根据基因序列设引物克隆出目的糖基转移酶基因，构建表达载体，在大肠杆菌中实现异源表达，最后得到伯克霍尔德菌中存在人参皂苷底物的糖基转移酶的结论。此外，我们也对实验条件如诱导剂浓度等方面上进行了初步优化。

关键词： 人参皂苷 糖基转移酶 异源表达

Analysis and Cloning of the Glycosyltransferase Genes for Synthesis of Ginsenosides

Abstract

Ginsenosides are the main active ingredients of ginseng which is a well-known Chinese medicine in daily life.The purpose of this dissertation is to analyze and clone the gene of ginsenoside glycosyltransferase.We main adopt the gene-hunting method in this experiment .We first acquire a kind of late-model glycosyltransferase from Burkholderia cepacia,and then clone the target glycosyltransferase gene based on the gene sequence and design primers to construct an expression vector for heterologous expression in E. coli.Finally, the conclusion was drawn that glycosyltransferases of ginsenoside substrate exist in Burkholderia. In addition, We also conducted preliminary optimization of experimental conditions such as concentration of inducer.

Key word: rare ginsenoside glycosyltransferase ;gene analysis ; clone ; optimization

目录

第一章 文献综述 1

1.1人参皂苷的简介 1

1.2 人参皂苷的功能 1

1.3目前已有的皂苷合成方法 2

1.3.1 植物提取法 2

1.3.2化学合成法 2

1.3.3 生物酶法合成 2

1.4 人参皂苷酶法合成的进展与前景 3

第二章 伯克霍尔德菌来源糖基转移酶基因的克隆与表达 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 菌株原料选择 4

2.2.2使用设备 5

2.2.3 培养基 6

2.2实验方法 6

2.2.1洋葱伯克霍尔德菌基因组的提取 6

2.2.2目的基因UDP-糖基转移酶基因的选取及PCR扩增 6

2.2.3胶回收UDP-糖基转移酶基因 7

2.2.4质粒 pET-28a( )的提取 8

2.2.5大肠杆菌感受态的制备及转化感受态 9

2.2.6 表达体系的构建 9

2.2.7 菌落 PCR 鉴定阳性克隆与测序 10

2.2.8 重组菌的表达 11

2.2.9 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 12

2.3 结果与讨论 13

2.3.1糖基转移酶基因的克隆 13

2.3.2 表达载体的构建及验证 13

2.3.3糖基转移酶基因的表达及条件优化 14

2.4 本章小结 16

第三章 结论与展望 17

3.1 结论 17

3.2 展望 17

参考文献 18

致谢 21

文献综述

1.1人参皂苷的简介

人参皂苷是我们日常生活中耳熟能详的中药材人参的活性成分。作为三萜皂苷，它从基本结构来看都是甾烷类固醇核——30个碳原子构成4个环，具体如下图1-1所示：

图1 -1人参皂苷结构式

中药材如西洋参、人参和三七，它们中的大多数均是日常生活可以接触的中药材保健药品，其主要活性成分就是人参皂苷，使得具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抑制细胞凋亡的活性，从而成为广泛推崇的保健药品。随着人参类保健品越来越向市场深处推广，所以我们持续致力于研究人参皂苷的各个方面，包括它的物理化学性质，药理功能机制，并且追求高效创新的研究方法^[1]。

1.2 人参皂苷的功能

经过上述阐述可知，人参自古以来都是保守推崇的药品，例如抑制肿瘤细胞DNA合成并诱导其凋亡分化甚至可以免疫肿瘤或抵制肿瘤细胞扩散。在当今社会，癌症已经可以说是高发疾病，根据最新2017年相关调查显示，全中国每天有约一万人或被确诊为癌症。从这一调查结果出发，人参皂苷对全人类的健康发展具有无法衡量的深远意义，我们有必要采取创新措施持续不间断地研究人参皂苷的活性及合成，有效应用到疾病治疗当中去。

首先，按照类别简单分析人参皂苷的有效单体成分，人参皂苷若含有一定的的单体成分，同时具备该单体成分所具有的特定功能，如下表1-1简单例举典型性人参皂苷单体及其功能：

表1-1人参皂苷的个别单体成分及其功能

1.3目前已有的皂苷合成方法

查找已发表的文献资料，现在可以总结出的合成人参皂苷的方法大致可以总结概括如下：植物直接获取法、化学合成和生物酶法合成（表1-2）。

1.3.1 植物提取法

植物提取是获得天然人参皂苷最直接的方法，但根据皂苷在人参不同部位的含量：花蕾部位总共含有15%、人参茎叶部位总共含有7.6%-12.6%、人参须根部位共含有8.5%-11.5%、人参主根部位共含有2%-7%人参幼根部位总共含有3%、种子总共含有0.7%可以看出，具有药理活性的人参皂苷含量甚微^[4]。但是这个方法耗时耗力，人参之所以珍贵，一方面原因就是它的培育年限需要4~15年，生长上由于培育环境或虫害困扰等各种方面因素更加使得其最后的收成品质受到限制。所以，植物提取法事倍功半，因为不经济实用并不受推崇使用^[5]。

1.3.2化学合成法

已有实验验证，如果初始原料选择植物人参的茎叶部位，碱选择乙醇钠，溶剂选择叔丁醇，那么就可以从人参植物茎叶中提取原人参二醇和原人参三醇，然后进行糖苷化反应合成。这一方法主要用于合成难度较小的原人参二醇类人参皂苷，虽然并不存在合成难度，但是由于糖苷键总是不能有效构建而使得这一方法的实用性大打折扣^[6-8]。

1.3.3 生物酶法合成

植物次代谢工程发展越来越迅速，那么我们研究三萜皂苷生物合成途径及相关糖基转移酶酶就可以利用分子生物学和基因工程方法，以下简单概括三个阶段揭示人参皂苷的生物酶合成途径：（1）乙酰CoA虽是糖酵解的产物但在这里可作为原始供体并通过甲羟戊酸途径合成IPP和DMAPP^[9]；（2）2,3-磺基新癸烯由烯丙基经由转移酶和醌环化酶催化下合成^[10]；（3）2,3-氧代喹喔啉进行环化，反过来形成三萜碳环骨架的复杂修饰。综合以上的反应步骤我们就可以合成目标产物人参皂苷^[11]。

其中，我们需要研究的糖基转移酶催化单糖与三萜糖苷结合成糖苷键^[12]。因为糖基转移酶虽然不具备明显的同源性性质，但它们必含有相似的结构域，故基于此催化特征的序列相似性和分类，参与人参皂苷合成的糖基转移酶通常含有PSPG基序，它是糖基转移酶与底物UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖的相连处。

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