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摘 要

替比夫定是治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物药物，在临床上使用广泛。虽然起效快，但是存在较强的毒副作用，关键是药物不具有肝靶向性。可以利用半乳糖将药物准确运送到肝脏部位。核苷类药物传统的制造方法一般为化学合成法，但是这种方法步骤繁琐，操作难度大，反应时间较长等多种问题。相对比来说用酶法合成的方法效率高、条件温和、副反应少、利与环保。

本次实验用BMG作为催化剂，用乳糖作为供体，对替比夫定的生物酶法合成工艺进行了优化：通过单因素实验优化实验条件确定酶法合成替比夫定反应过程中pH值、温度、乳糖浓度、非水相体系等工艺条件。

本实验对比不同反应条件的影响，最终发现pH 为7.5、温度为35 ˚C、乳糖浓度为150 g/L、DMSO占比为10%这样的条件下反应最优。

关键词： 替比夫定 肝靶向 酶法合成

Study on Optimization of Enzymatic Synthesis Preparation Process of Liver Targeting Nucleoside Galactosyl Telbivudine

Abstract

Tibivdine is a nucleoside analogue for chronic hepatitis b and is widely used in clinical practice. Although effective quickly, but there is a strong toxic side effect, the key is that drugs do not have liver targeting. The drug can be delivered to the liver accurately using galactose. The traditional manufacturing method of nucleoside drugs is usually chemical synthesis, but this method is complicated, difficult to operate and has a long reaction time. Enzymatic synthesis is relatively efficient, mild, less adverse, and environmentally friendly.

This experiment BMG was used as catalyst, using lactose as a donor, than to substitute, enzymatic synthesis process has been optimized: experimental conditions are optimized by the single factor experiment determined for than, enzymatic synthesis reaction in the process of pH, temperature, concentration of lactose, the process conditions such as water phase system.

Experiment compared the influence of different reaction conditions, finally found that pH is 7.5, temperature is 35 ˚ C, lactose concentration of 150 g/L, DMSO 10% so that the optimal conditions of the reaction.

Keywords: telbivudine; liver targeting; galactosyl; enzymatic synthesis

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 研究背景 1

1.2 国内研究现状 1

1.2.1替比夫定的作用机制 1

1.2.2替比夫定的功效 1

1.2.3替比夫定的合成方法比较 2

1.3 替比夫定的简介 2

1.3.1替比夫定的性质 2

1.3.2替比夫定的优点 3

1.3.3替比夫定的应用和研究前景 3

第二章 非水相体系优化合成半乳糖基核苷类产物 5

2.1 实验的材料 5

2.1.1实验仪器 5

2.1.2实验试剂 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 β-半乳糖苷酶BMG的制备及其活性检测 6

2.2.2 替比夫定糖基化反应条件的优化 6

2.2.3 亲水性有机溶剂对替比夫定半乳糖基化反应的影响 7

2.2.4 BMG催化替比夫定半乳糖基化反应的动力学分析 8

2.2.5 10% DMSO体系中酶法半乳糖基化替比夫定 8

2.2.6 替比夫定及其糖基化产物HPLC分析 9

2.2.7产物的分离、纯化及结构鉴定 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 BMG催化替比夫定糖基化反应条件的优化数据分析 10

3.2 非水相体系对替比夫定半乳糖基化反应的调控数据分析 12

第四章 结论与展望 14

4.1 结论 14

4.2 展望 14

参考文献 16

致谢 19

第一章 文献综述

1.1 研究背景

在现如今的世界上，感染乙型肝炎病毒的人越来越多，且地区分布广泛，来自世界卫生组织的情报信息显示，全世界大约有HVB感染者20亿人之多，在这之中大约感染慢性HVB的人有3.5亿。大约有75%感染慢性乙肝者生活在亚洲地区，乙肝发病率最高的国家是中国。做为一种潜在的疾病，慢性乙型肝炎是具有一定的危险性，研究表明，肝纤维化，肝硬化，肝癌的发病率在慢性乙型肝炎患者中显著增加。做为人工合成的L型核苷类药物，替比夫定拥有高病毒应答率、高e抗原血清学转化率和高转氨酶复常率等特点，且属于妊娠B级药物，因此得到广泛使用。在拥有广泛市场的中国，将合成过程变简单，合成步骤更优化，将会是今后研究的主要方向。

1.2 国内研究现状

1.2.1替比夫定的作用机制

做为一种前药，自身不具有活性，在细胞激酶的作用下，替比夫定被被这个细胞激酶所磷酸化，生成三磷酸盐。这种三磷酸盐具有一定的活性，会产生一种竞争效应，拥有的活性HBV逆转录酶就被这种竞争抑制了，做为HBV前体的mRNA的反转录被阻碍，HBV-DNA的合成被终止，但是HBV-DNA的起始不能被抑制。高特异性和高选择性是替比夫定的两大特点，人体正常聚合酶的功能不被它的活性代谢物所影响。在抑制HBV-DNA的过程中，宿主的免疫系统间接被替比夫定所调节，其可能机制是下调循环中的调节性T细胞，重建抗病毒的免疫系统。

1.2.2替比夫定的功效

做为一种新的的左旋核苷类似物，被用于治疗慢性乙型肝炎，特异性、强效抑制HVB是替比夫定的两大特点，艾滋病病毒和其他病毒不被影响。HBV-DNA转阴率、e抗原血清转化率和转氨酶复常率是用来评价替比夫定的抗病毒疗效的主要指标。在做的体外的实验中，对于HBV替比夫定展现出较高的效能和选择性。在GOLBE试验中，42%和33%分别是替比夫定2年的e抗原消失率和e抗原血清转换率。

1.2.3替比夫定的合成方法比较

化学合成法一直以来作为的传统合成方法，历经多年，但是我们发现用这种方法合成核苷类药物步骤繁琐，操作难度较高，反应历经的时间长，而且反应过程中会产生一定量的异构体。举个例子，天然核苷进行化学修饰时如果用化学法进行修饰的话，一般都要先把碱基或者核糖基团保护起来，在接下来的反应中把保护基团除去，用这种方法合成反应往往会导致总收率变低。

酶法合成核苷类药物的优点：当需要合成繁琐的生物分子时，酶能选择特定的基团与之结合，不需要保护基团，用酶反应合成时，酶反应效率较高，可以是天然底物类似物可以作为酶反应的底物。如果菌体中含有核苷酸磷酸化酶，这一类菌体可以进一步用来合成核苷类药物。

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