论文总字数：20514字

摘 要

为进一步拓展蛋白酶在催化领域中的应用，本课题以制备酶触发水凝胶自组装、GO肽偶联物的制备为核心研究内容，研究嗜热蛋白酶在药物多肽及软材料合成中的应用及制备水凝胶包载的石墨烯在药物应用中的发展前景。

本实验基本组装模块为Fmoc基团保护的氨基酸与三肽,整合到DOPA肽链中，细胞粘连增强型水凝胶是由Fmoc基团及疏水性氨基酸之间的非共价键作用力所构建。此次实验的催化剂是具有高效的肽键缩合力的蛋白酶WQ9-2。与利用传统的物化学条件如pH、离子强度、温度及紫外照射等的变化触发自组装相比，酶促自组装具有更好的生物相容性与时空可控性，条件温和，适合原位成胶，可应用的领域更多，比如原位给药、作为组织骨架材料等等。纳米石墨烯具有巨大的比表面积、导电性能和光热转换能力。巨大的比表面积使其能够包裹小分子药物、能够作为药物载体，光热转换能力使得石墨烯能够吸近红外光转化为热量，用于肿瘤治疗。GO通过改进的Hummers法使用石墨粉末作为起始材料，进一步羧化，再将GO与肽缀合制备GO肽偶联物。

关键词：水凝胶 生物相容性 酶促自组装 氧化石墨烯 细胞穿膜肽

Preparation of hydrogel-encapsulated graphene

Abstract

In order to further expand the application of proteases in the field of catalysis, this research focuses on the preparation of enzyme-triggered hydrogel self-assembly and the preparation of GO peptide conjugates, and studies the application of thermophilic proteases in the synthesis of pharmaceutical peptides and soft materials. Preparation of hydrogel-encapsulated graphene in the development of pharmaceutical applications.
In this experiment, the basic assembly module is an Fmoc group-protected amino acid and tripeptide that is integrated into the DOPA peptide chain. The cell adhesion-enhanced hydrogel is constructed from noncovalent interactions between Fmoc groups and hydrophobic amino acids. . The catalyst for this experiment was protease WQ9-2 with high peptide bond condensation power. Compared with the use of traditional physical chemical conditions such as pH, ionic strength, temperature and UV irradiation to trigger self-assembly, enzymatic self-assembly has better biocompatibility and space-time controllability, mild conditions, suitable for in situ Gelatin can be applied in more fields, such as in-situ administration, as a tissue skeleton material, and the like. Nano-graphene has a large specific surface area, electrical conductivity, and photothermal conversion capability. The large specific surface area makes it possible to enclose small-molecule drugs and can be used as a drug carrier. The photothermal conversion capability enables graphene to absorb near-infrared light into heat for cancer treatment. GO was further carboxylated using a modified Hummers method using graphite powder as a starting material, followed by conjugation of GO to the peptide to prepare a GO peptide conjugate.

Key words: hydrogel； Biocompatibility enzymatic ；self-assembly ；graphene oxide；cell-penetrating peptides

目 录

摘要 2

Abstract 3

第一章 文献综述 6

1.1.酶响应水凝胶 6

1.2枯草芽孢杆菌来源嗜热蛋白酶催化合成小肽水凝胶 6

1.3石墨烯 7

1.3.1石墨烯与氧化石墨烯 7

1.3.2氧化石墨烯的功能化 7

1.3.3氧化石墨烯可以作为运输载体 8

1.3.4氧化石墨烯作为药物载体方面的应用 8

1.4、细胞穿膜肽 9

1.4.1 CPPs的分类 9

1.4.2 细胞穿膜肽的穿膜摄取机制 9

第二章、水凝胶的制备和表征 11

2.1水凝胶的制备前言 11

2.2 实验材料 11

2.2.1 实验试剂 11

2.2.2 实验仪器 12

2.3 实验方法 12

2.3.1 酶触发水凝胶自组装的实验 12

2.4水凝胶的表征 12

2.4.1最低成胶浓度的确定的实验 12

2.4.2 反应产物的检测 13

2.4.3 扫描电镜与环境扫描电镜表征 13

2.4.4 透射电镜表征 13

2.4.5 流变学性能表征 13

2.4.6 荧光光谱扫描 13

2.5结果与讨论 14

2.5.1 分子设计 14

2.5.3 发射光谱表征成胶 15

2.5.4 水凝胶微观形态表征 15

第三章、石墨烯的制备和表征 17

3.1前言 17

3.2实验材料 17

3.2.1实验试剂 17

3.2.2实验设备 18

3.3石墨烯的制备 18

3.3.1羧化GO混悬液的制备 18

3.3.2 GO肽偶联物的制备 18

3.4石墨烯的表征 19

3.4.1石墨烯的红外表征 19

3.4.2石墨烯的电位和粒径表征 19

3.5结果与讨论 19

3.5.1 GO肽偶联物成果 19

3.5.2石墨烯红外表征分析 19

3.5.3石墨烯及其肽偶联物粒径、电位表征 20

第四章、展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 文献综述

1.1.酶响应水凝胶

自2004年首次报道形成磷酸酶刺激肽水凝胶以来，酶响应性水凝胶已引起人们的关注。肽源自生物体，是酶作用的最重要的底物之一。因此，大多数酶响应性水凝胶是基于肽及其衍生物，以及具有酶作用位点的合成聚合物[1]。肽水凝胶的降解产物是氨基酸，它通常不会在人体内引起非特异性免疫应答。因此，肽及其衍生物被广泛研究作为酶响应性水凝胶的组分。

图1-1短肽Nap-FFGEY在激酶和磷酸酶作用下的动态转换

1.2枯草芽孢杆菌来源嗜热蛋白酶催化合成小肽水凝胶

Ulijn和他的团队首先测试了肽组件的蛋白质组催化自组装。 2006年，该团队首次报道JACS使用嗜热菌蛋白酶催化Fmoc-氨基酸与Phe-Phe的肽键缩合，形成多种具有自组装能力的小肽[2]。 2008年，基于Fmoc-Phe / Phe-Phe的嗜热菌蛋白酶催化自组装[2]发表在Nature sub issue nanotechnology上。 。由于自组装系统的自修改，组分选择性和时空可控性，基于肽基水凝胶的水凝胶自组装具有较强的理论和实践指导价值。该团队还通过由枯草芽孢杆菌水解Fmoc-肽甲基酯产生具有自组装能力的小肽[3]。除了这些酶之外，金属蛋白酶-9（MMP-9）目前用于该领域。 Xu和其他研究人员设计了一种短肽FFFFCGLDD，其中含有可被MMP-9鉴定的氨基酸位点，并通过切除三个氨基酸（LDD）使剩余的短肽自组装[4]。由于酶催化自组装水凝胶本身是一个新兴的研究领域，蛋白酶是各种生物触发方法之一。在Ulijn之后，没有其他研究人员在这个领域取得了显着

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