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摘 要

目的：为了研究冬凌草甲素抑制骨肉瘤上皮间质转化的作用机理，考察冬凌草甲素作用于人骨肉瘤MG-63细胞后，如何影响骨肉瘤上皮间质转化。

方法:使用不同浓度的冬凌草甲素分别作用于人骨肉瘤MG-63细胞，使用MTT法测定冬凌草甲素对细胞活力的影响，选出对细胞活力无明显损伤的浓度。用细胞划痕实验测定给药后中间划痕的修补情况来验证冬凌草甲素对MG-63细胞迁移能力的影响。用细胞侵袭实验测定在冬凌草甲素作用下细胞侵袭的能力，进一步确认冬凌草甲素对于人骨肉瘤MG-63细胞的上皮间质转化的抑制能力。用蛋白质印迹法测定E-cadherin、N- cadherin、Snail、Slug、Vimentin、β-actin蛋白的表达情况，用来分析冬凌草甲素对骨肉瘤上皮间质转化的影响。

结果:通过MTT实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验和蛋白质印迹法发现，不同浓度的冬凌草甲素能够有效的抑制骨肉瘤细胞的上皮间质转化，并且表现出浓度依赖性。

关键词: 冬凌草甲素 骨肉瘤 上皮间质转化

Oridonin inhibits epithelial-mesenchymal transition in osteosarcoma cells

Abstract

OBJECTIVE: In order to investigate the inhibitory effect and the mechanism of oridonin on epithelial-mesenchymal transition of osteosarcoma.

METHODS: MTT assays were used to choose concentrations of oridonin without significant effects on cell viability of human osteosarcoma MG-63 cells. The effect of oridonin on the epithelial-mesenchymal transition was verified by the cell scratch test to determine the repair of human osteosarcoma cell metastases. Cell invasion assay was used to determine the ability of cell invasion under the influence of oridonin. Western Blot assays were used to determine the protein expressions of E-cadherin, N-cadherin, Snail, Slug and Vimentin and confirm the inhibitory effect of oridonin on the epithelial-mesenchymal transition of human osteosarcoma MG-63 cells.

RESULTS: Cell scratch assay, cell invasion assay and Western Blot assay showed that different concentrations of oridonin effectively inhibited the epithelial-mesenchymal transition of osteosarcoma cells in a concentration-dependent manner.

Keywords: oridonin; osteosarcoma; epithelial-mesenchymal transition (EMT)

目　　录

第一章 文献综述 1

1.1冬凌草甲素的基本性质 2

1.2冬凌草甲素的药效及药理作用 2

1.2.1促进肿瘤细胞的凋亡 2

1.2.2阻碍某些通道信号的传导来实现降低细胞的繁殖 3

1.2.3降低端粒酶活性 3

1.2.4抗突变作用 3

1.2.5 增强其他抗肿瘤药物的疗效 4

1.3冬凌草甲素的研究现状 4

1.4 骨肉瘤的研究现状 4

1.5 上皮间质转化研究现状 5

第二章 材料和方法 6

2.1材料 6

2.3 实验方法及原理 7

2.3.1 体外细胞培养 7

2.3.2 MTT法测定细胞活力 8

2.3.3 细胞划痕实验 9

2.3.4 细胞侵袭实验 9

2.3.5 Western Blot印迹法实验 10

第三章 结果与讨论 12

3.1 MTT法结果 12

3.2 细胞划痕实验结果 12

3.3 细胞侵袭实验结果 13

3.4 Western Blot印迹法实验结果 14

第四章 结论 15

参考文献 16

致 谢 18

第一章 文献综述

冬凌草因为结霜时会出现附着于叶片表面的冰凌片，因此也被称为冰凌草。自古，太行山地区人民就常常把它当做茶叶来使用，也正因为它的解热解毒、消炎止痛等功能，受到了当地人的广泛欢迎，同时也被称为“神奇草”。冬凌草甲素在《现代中国药理学词典》中有收录。词典把冬凌草的特征和作用描述为苦、甜、微寒、清热解毒、活血止痛等。冬凌草还常被用于咽喉痛、蛇咬、风湿痛、咽喉炎等，主要功能是抗肿瘤、干燥、抗菌、解热。70年代的时候，冬凌草被当做食管癌贲门癌治疗过程中的常用药，因为它的治愈率非常高，这引发了河南省卫生厅的持续关注，也因此引发了诸多研究单位和有兴趣的学者对于冬凌草的药理作用、临床应用方面的深入研究。在这个过程中他们发现了冬凌草中最主要的抗癌成分，冬凌草甲素和冬凌草乙素^[1]。但是自从冬凌草的宝贵价值被人们发现，由于缺少系统的管理和知识储备，冬凌草一度被过度采摘，冬凌草也不可避免地出现品种退化、数量稀少等问题^[2]。当然，随着人们对于冬凌草种植的重视和对冬凌草目前尴尬处境的认识，人工种植冬凌草已经能够有规模有计划的进行。到目前为止，多数学者对冬凌草的研究重心仍是在药理作用和化学成分方面。阅读诸多有关于冬凌草甲素抗癌作用的文献，发现冬凌草甲素在很多癌症治疗中都能发挥作用，其中较为典型的是在结肠癌、乳腺癌、食管癌治疗过程，冬凌草甲素都能够起到诱导癌细胞进一步凋亡以及抑制癌细胞的扩散的作用，在整个治疗过程中也没有发现其对于正常细胞生长增殖有所损害。冬凌草甲素在癌症治疗中已经成为众多学者的研究中心之一。但是，目前冬凌草抗肿瘤作用的具体机制尚未清楚。

骨肉瘤是一种儿童期和青春期常见的恶性骨肿瘤。 1970年以前，骨肉瘤的首选治疗方案是截肢治疗，但例如肩部肿瘤或转移肿瘤，截肢的方案就很难奏效。因为医疗卫生知识的匮乏，80％的患者在确诊时已经很晚，并且多数有轻微的转移，这部分患者因为肿瘤的转移大都死于1 年以内 ^[3]。近年来，随着科学技术和医疗水平的发展，骨肉瘤的治疗方法已经变成以保肢治疗为主了，同时5年间总生存率也从20％提高55％，达到75％。但是，近年来的骨肉瘤治疗遇到了很多新的问题，尤其是对与骨肉瘤转移方面和有些患者对于药物呈现耐药性的问题，这些都促使我们要去研发新的药物和治疗方式。

本课题的目的是以人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象，进行MTT实验、细胞划痕和细胞侵袭实验，获得癌细胞侵袭与迁移的各项指标，从而得知冬凌草甲素对于骨肉瘤细胞上皮间质转化有何影响。

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