论文总字数：24983字

摘 要

番茄红素（lycopene）是自然界中非常重要的天然类胡萝卜素之一，可在成熟西红柿中提取。随着代谢工程和合成生物学的引入，基因工程技术的提高使得人们越来越关注番茄红素的生产方法——微生物发酵法，随着与番茄红素合成酶基因的克隆，通过基因修饰使关键基因过表达，抑制基因表达、基因敲除等，调控代谢过程，使用重组DNA技术来构建出有较高产量的工程菌。酵母系统是基因工程中安全的宿主菌。酵母已进行了全基因测序、基因表达调控机理、遗传背景较为清楚，并且酵母菌在发酵中利用广泛、技术成熟、工艺简单、成本低廉。本课题以构建酿酒酵母中生产番茄红素的重组质粒为出发点，由pET-EBI扩增出基因片段crtI、crtB和crtE，并且通过酶切使之与pESC-LEU连接，分别利用融合蛋白与启动子优化的策略构建了ESC-IEB和ESC-IBE两种利用MVA途径生产番茄红素的重组质粒，并且转化酿酒酵母进行表达，构建出高产量的酵母工程菌株。

关键词：番茄红素 基因工程 酿酒酵母 重组质粒

ABSTRACT

Lycopene is a very important kind of natural carotenoids in nature, and it can be extracted from mature tomatoes. With the introduction of metabolic engineering and synthetic biology and the improvement of genetic engineering technology, the production of lycopene by microbial fermentation method has received widespread attention, which used recombinant DNA technology to build a higher yield of engineering bacteria with the lycopene synthase gene cloning, through gene modification, key gene overexpression, inhibition of gene expression, gene knockout, regulation of metabolic processes. The yeast system is a safe host strain in genetic engineering. Yeast has been sequenced for whole genome, the gene expression, regulation mechanism, and genetic background is more clear. Yeasts are widely used in fermentation with the mature technology, simple process, and low cost. In this study, genes crtI, crtB and crtE were amplified from plasmid pET-EBI, and ligated with pESC-LEU by restriction enzyme digestion. Two strategies of fusion protein and promoters optimization were used to construct the recombinant plasmids of ESC-IEB and ESC-IBE to produce lycopene by MVA pathway. Then the plasmid was transformed into Saccharomyces cerevisiae to construct high-yield yeast engineering strains.

KEYWORDS: Lycopene; genetic engineering; Saccharomyces cerevisiae; recombinant plasmid

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 番茄红素的功能 1

1.3 番茄红素的生产方法 2

1.3.1天然提取法 2

1.3.2化学合成法 2

1.3.3微生物发酵法 2

1.5 番茄红素的基因调控 4

1.6. 酿酒酵母表达体系^[25] 5

1.7 研究意义 6

1.8 研究内容 6

第二章 材料、设备与方法 8

2.1 实验材料 8

2.2 实验试剂 9

2.3 实验菌株引物与片段 10

2.4 试剂配制及器材操作 12

2.5 实验方法 13

2.5.1 PCR体系 13

2.5.2 琼脂糖凝胶电泳 15

2.5.3 胶回收 16

2.5.4 酶切与连接 16

2.5.5 大肠杆菌DH5α转化 17

2.5.6 提取质粒 17

2.6 实验流程 18

2.6.1 ESC-IEB质粒的构建 18

2.6.2 ESC-IBE质粒的构建 20

2.6.3 酿酒酵母感受态的制备与转化 23

2.6.4 酿酒酵母的筛选及发酵 23

2.6.5番茄红素提取及HPLC 24

第三章 实验结果与分析 25

3.1实验结果 25

3.1.1 ESC-IEB质粒的构建 25

3.1.2 ESC-IBE质粒的构建 29

3.1.3重组质粒转化入表达宿主酿酒酵母 32

3.2 结果分析 34

第四章 结论与展望 35

4.1 结论 35

4.2 展望 35

参考文献 36

致 谢 40

第一章 文献综述

1.1 引言

番茄红素是一类具有抗氧化活性的重要萜类化合物，主要来自于成熟期的番茄^[1]。1873年，番茄红素首次被人工提取出来。1903年这种红色晶体被正式命名为番茄红素，其有植物黄金，藏在西红柿里的黄金等美称^[2]，因其是类胡萝卜素中抗氧化最强的物质，而被广泛用于医药行业。此外，番茄红素还可以作为重要的食品添加剂和营养增补剂，得到了 FDA、EEC、WHO 等国际组织的认可^[3-4]。

1.2 番茄红素的功能

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