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摘 要

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，人类因恶性肿瘤引起的死亡率占所有疾病死亡率的第一位。NEDD8是一种类泛素蛋白，与泛素化途径相似，在细胞生理过程中主要参与稳定蛋白，调节底物蛋白活性及转录调节等功能。研究表明，II-18 具有良好的抗肿瘤增值活性、合理的脂水分配系数以及体外较低的溶血率。因此，我们选择 II-18 进行深入抗肿瘤机制和靶点确证研究。II-18是一种抑制NEDD8活化酶的小分子抑制剂,能够与NEDD8活化酶(NAE)结合形成复合物，抑制NEDD8活化酶活性控制部分E3（CRLs）活性，从而特异性减少细胞内与肿瘤相关蛋白的降解。研究发现，以NAE为靶点， II-18作为NAE的抑制剂，从而研究高效低毒抗肿瘤药物具有广泛前景。

本研究以人胃癌细胞（AGS细胞）为研究模型，以本课题组前期得到的优选化合物II-18对泛素蛋白酶体通路的影响，观察其对细胞生长的抑制作用，分析其干预后AGS细胞的增殖活性，周期调控蛋白的表达，探讨II-18这一化合物对细胞增殖相关信号通路的调控，明确II-18这一化合物对AGS细胞增殖分子机制。

关键词： II-18 NEDD8 NAE抑制剂 抗肿瘤药物

ABSTRACT

Cancer is a serious threat to human health Human mortality. Due to malignant tumors caused by all accounts，which is the first disease for human mortality. NEDD8 is a ubiquitin-protein similar to ubiquitin pathway in cell physiological processes , mainly involved in protein stability, regulating the activity of substrate proteins and the transcriptional regulatory and other functions. Studies have shown that, II-18 has a NEDD8 kinase inhibitor of the ubiquitin - proteasome pathway regulating mechanism NEDD8 kinase inhibitor of the ubiquitin - proteasome pathway regulating mechanism good anti-tumor activity value, reasonable lipid-water partition coefficient and lower in vitro hemolysis. Therefore, we chose II-18 anti-tumor mechanism of depth and target validation studies. II-18 is an inhibitory NEDD8-activating enzyme small molecule inhibitors, capable of NEDD8 activating enzyme (NAE) to form a complex, suppressed NEDD8 live Enzymes control section E3 (CRLs) activity, thus reducing the specific tumor cells and degradation of related proteins. The study found that targeting to the NAE, II-18 as inhibitors of NAE, so research efficiency and low toxicity of anticancer drugs has broad prospects.

In this study, studying with the human gastric cancer cells (AGS cells) as the model, the impact of the preferred compounds. Our previous obtained II-18 of the ubiquitin-proteasome pathway, observe the inhibitory effect on cell growth, analysis of their interventions AGS cells proliferative activity, regulation of protein expression period, investigating the compound II-18 on cell proliferation related signal transduction pathway clear of AGS cell proliferation II-18 molecular mechanism of this compound.

Key Words: II-18;NEDD8; NAE inhibitor; Antineoplastic drugs

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 实验背景 4

第二章 实验材料 6

2.1细胞株 6

2.2 主要试剂和耗材 7

2.3主要抗体 7

2.4主要仪器 8

2.5主要试剂和药物的配置 8

2.5.1 Western Blot所用主要试剂的配置 8

第三章 实验方法 10

3.1 II-18对细胞内NAE活性及CRLs底物蛋白的影响 10

3.2 细胞增殖活力检测 12

3.3 II-18的ATP竞争性NAE抑制实验（Cell-free） 12

3.4细胞凋亡测试 13

3.5细胞周期检测 13

3.6数据分析 13

第四章 实验结果 15

4.1 II-18抑制AGS细胞的NAE活性影响 15

4.2 II-18抑制 AGS 细胞内 CRLs 底物降解影响 16

4.3 II-18 对细胞内选择性检测 17

4.4 II-18诱导AGS细胞凋亡 17

4.5 II-18 对AGS细胞周期G1期的影响 19

4.6 II-18 与硼替佐米具有协同作用 20

第五章 讨论 22

第六章 结论与展望 24

6.1 结论 24

6.2 展望 24

参考文献 26

致谢 29

第一章 实验背景

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，人类因恶性肿瘤引起的死亡率占所有疾病死亡率的第二位，仅次于心脑血管疾病。进行放射、药物治疗、手术、和生物治疗等是目前治疗肿瘤的主要方法，但目前重点主要是药物治疗^[1]。泛素蛋白酶体系统（UPS）在真核细胞中主要是负责降解蛋白质，而且会维持蛋白质在细胞内的动态平衡^[2]。UPS的底物蛋白参与诸如细胞周期调节、细胞生长及增殖、信号传导、DNA修复及细胞凋亡信号传导过程^[3]。因此，UPS失调则会导致信号通路的异常激活或抑制，进而可能发展成为肿瘤或其他疾病。实验表明，UPS通路在一些肿瘤细胞中是会被上调的，从而UPS被抑制了而后导致了该细胞的凋亡。近来硼替佐米被作为治疗多发性骨髓瘤的药物而上市，从而，通过调节UPS来治疗肿瘤具有高度可行性进一步被证明了^[4]。

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