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摘 要

Baeyer-Villiger氧化反应是化学中一个经典反应，至今仍在有机合成中担任着重要角色，越来越多的方法应用于具有经济价值的酯或内酯的合成。Baeyer-Villiger 单加氧酶(Baeyer-Villiger Monooxygenase, BVMOs)是一种重要的生物类催化剂，可以用来催化Baeyer-Villiger氧化反应。和其他已知的环己酮单加氧酶相比，苯丙酮单加氧酶（Phenylacetone Monooxygenase PAMO）具有良好的热稳定性，具有潜在的应用价值。但是其底物范围比较窄，仅限于芳香族酮类，如何拓展其底物范围是当前研究的热点。本研究利用已得到的PAMO突变体对以环己酮为底物的Baeyer-Villiger 单加氧反应进行测试，拓展该酶的底物范围。苯丙酮单加氧酶的四个突变体酶对于环己酮为底物的Baeyer-villiger氧化反应是否有活性需要进一步的探究。

关键词：生物催化 单加氧酶 苯丙酮单加氧酶 定向进化

Baeyer-Villiger Oxidation of Cyclohexanone Catalyzed by Phenylacetone Monooxygenase Mutants

ABSTRACT

Baeyer - Villiger oxidation reaction is a classic in the chemical reaction, still playing an important role in organic synthesis. More and more new catalysts are applied in this reaction to synthesize value-added ester and lactone. Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMOs) is one kind of important enzyme as biocatalysts involved in the Baeyer-Villiger oxidation of ketone. Compared to other known BVMOs, such as Cyclohexanone Monooxygenase (CHMO), PAMO is a thermostable enzyme that conferring it potential application. However, the substrate scope of PAMO is limited to aromatic ketones and Cyclohexanone is not accepted by PAMO. In this study, the catalysis activity of four PAMO mutants are determined in Baeyer-Villiger oxidation with cyclohexanone serving as substrate. The substrate scope of PAMO is able to be expanded by protein engineering.

Key words: biocatalysis Monooxygenase Phenylacetone Monooxygenase directed evolution

目录

摘要 II

第一章 文献综述 1

1.1 Baeyer-Villiger氧化反应 1

1.1.1 Baeyer-Villiger氧化反应的机理 1

1.1.2 Baeyer-Villiger氧化反应的优点 1

1.2苯丙酮单加氧酶 2

1.2.1苯丙酮单加氧酶(PAMO)的概述 2

1.2.2苯丙酮单加氧酶（PAMO）的性质 3

1.2.3苯丙酮单加氧酶(PAMO)的应用 4

1.3本课题的研究内容及意义 4

1.3.1 研究意义 4

1.3.2 研究内容 5

第二章 实验过程 6

2.1 实验材料 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 实验准备 7

2.2.1.1试剂的配制 7

2.2.1.2 LB培养基的配制 7

2.2.2大肠杆菌感受态细胞制备 9

2.2.3 电转化 10

2.2.4 提质粒 11

2.2.5 蛋白的表达纯化及蛋白凝胶电泳 12

2.2.6 PAMO突变体催化的生物催化和生物转化 14

2.3 结果与讨论 15

2.3.1 质粒提取 15

2.3.2 PAMO突变体的表达 15

2.3.3 PAMO突变体催化的环己酮单加氧反应 16

2.3.4 本次实验的不足以及改进方向 18

2.4 本章小结 19

第三章 结论与展望 20

3.1 结论 20

3.2 展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 Baeyer-Villiger氧化反应

1.1.1 Baeyer-Villiger氧化反应的机理

十九世纪末期，Adolf Baeyer和Victor Villiger发现了一种能将酮和环酮氧化成酯和内酯的反应，因此，人们便将这类反应命名为Baeyer-Villiger氧化反应。普遍接受的Baeyer-Villiger反应机理^【1】（图式1.1.1）是：第一步，利用过氧酸对酮的羰基碳进行加成从而生成含四面体结构的“Criegee”中间体，第二步，中间体重排产生相应的酯类或内酯类。

图式1.1

1.1.2 Baeyer-Villiger氧化反应的优点

Baeyer-Villiger氧化反应是化学中一个经典反应，至今仍在有机合成中担任着重要角色，经过一个多世纪的发展，将酮或环酮转化为更复杂，更有价值的相对应的酯类或内酯类已经有了越来越多的方法，同时Baeyer-Villiger氧化反应也普遍适用于许多方面，比如合成很多的天然产物的有机中间体以及一些高分子材料的单体（如ε-己内酯）等^【2-3】。Baeyer-Villiger氧化反应的优点有以下几个方面^【4-5】:(1)当反应物分子中含有其他官能团时(如不饱和酮中的C=C双键),氧化只发生在羰基上，其他官能团可不受影响;(2)可根据迁移特性不一样的迁移基团来更直接地控制生成物的立体化学结构;(3)如果发生迁移的碳原子是手性碳,那么它迁移前后的绝对构型是不会发生变化的;(4)Baeyer-Villiger氧化反应中可供使用的氧化剂和催化剂非常多;(5)该反应可以氧化很多含碳化合物,例如:可将酮或环酮氧化生成相对应的酯类或内酯类、将苯甲醛氧化生成对应的苯酚类、羧酸氧化生成对应的酸酐等。

Baeyer-Villiger 氧化反应能直接有效地调整生成物的立体化学结构， 在化学合成中对功能基团的转化和环的扩张有非同一般的影响，因此氧化获得的生成物能够普遍应用于合成许多天然化合物和药物中间体以及一些高分子材料的单体等，这是目前有机化学研究的一个热点。如今随着对该反应越来越深入的探索，其催化剂的种类也越来越多，例如均相催化剂、非均相催化剂和生物催化剂。均相催化剂虽然有着不错的选择性和转化率，但是它的重复利用率不如非均相催化剂高。另外，生物催化剂是一种绿色环保，符合未来研究趋势的催化剂，是未来研究的一个重点方向。

1.2苯丙酮单加氧酶

Baeyer-Villiger 单加氧酶(Baeyer-Villiger monooxygenases， BVMOs)是一种重要的生物类催化剂，可以用来催化合成一系列有价值的酯和内酯化合物.该类酶是一种黄素类酶， 能够催化有机物分子直接加氧原子，也就是催化一个氧原子直接与底物发生反应，另一个氧原子则被还原成H₂O^[6](图式1.2)。单加氧酶BVMOs还可以对链酮和环酮进行催化，从而进行立体选择性的Baeyer-Villiger氧化反应， 将反应物转变生成相应的酯类或内酯类。该酶在氧化过程中依赖于 NAD(P) H、 氧气和黄素辅酶^[7-8]等提供还原黄素用的电子。反应需要还原型辅助因子， 如 FAD、 NADP、 抗坏血酸、 铜和铁及细胞色素c，所需辅助因子随各种单加氧酶而异。这类生物催化剂具有很好的化学选择性、不错的区域选择性和光学异构选择性^[9]。

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