论文总字数：23261字

摘 要

脂肪酶作为一种优秀的化合物催化剂被广泛应用于医药、化工等重要领域。然而游离的脂肪酶在催化过程中容易失活，而且存在难以回收利用的问题，使其的发展前景收到影响。而对其固定化可以改善解决这一系列问题。

文斯内酰胺及其衍生物（例如，N-羟甲基文斯内酰胺等）作为药物活性化合物制备的合成子，最初被用于碳环核苷的合成，具有重要的应用意义。

本课题采用介孔二氧化钛作为载体对脂肪酶进行固定化研究，优化脂肪酶固定化的条件，并将其应用于拆分重要医药中间体N-羟甲基文斯内酯，固定化脂肪酶显示出了良好的利用率和催化效率。

关键词：脂肪酶 固定化 酶学性质 手性拆分 N-羟甲基文斯内酯

Immobilization of lipase and its application in drug intermediates split

ABSTRACT

Lipase as an excellent compound catalyst which is widely used in pharmaceutical, chemical and other important areas. However，it is difficult for free lipase to recycle in the process of catalytic reaction which limits the application. The immobilization of lipase is needed to solve these problems.

Vince lactam, 2-azabicyclo [2.2.1] hept-5-en-3-one and its derivatives (for example, N-hydroxymethyl vince lactam, et al) have great potential as the synthons in preparation of pharmaceutically active compounds, which was initially used in the synthesis of carbocyclic nucleosides.

In this study, the mesoporous TiO₂ was used as support for immobilization of lipase. Moreover, this study investigated the application of immobilized lipase in the kinetic resolution of racemic N-hydroxymethyl vince lactam. The immobilizated lipase showed excellent catalytic properties in resolution of intermediates of chiral drugs.

KEYWORDS: Lipase; Immobilized; Enzymatic Properties; Chiral Separation; N-hydroxymethyl vince lactam.

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 脂肪酶概述 1

1.1.1 脂肪酶的来源 1

1.1.2 脂肪酶的催化机理 2

1.2 脂肪酶的固定化方法 2

1.2.1 吸附 3

1.2.2 包埋 3

1.2.3 交联 4

1.2.4 共价结合 4

1.3 脂肪酶在手性药物拆分中的应用 5

1.3.1 固定化脂肪酶在酯类拆分中的应用 5

1.3.2 固定化脂肪酶在仲醇类拆分中的应用 6

1.3.3 小结 7

1.4 介孔材料的应用 7

1.4.1 介孔材料概述 7

1.4.2 介孔二氧化钛的改性及在固定化中的应用 7

1.5 本课题研究的内容及意义 8

第二章 脂肪酶YCJ01的固定化以及固定化条件的研究 11

2.1 前言 11

2.2 实验材料 11

2.2.1 实验试剂 11

2.2.2 实验仪器 12

2.2.3 菌种来源 13

2.3 实验方法 13

2.3.1 脂肪酶YCJ01的制备 13

2.3.2 介孔TiO2载体的表面修饰 14

2.3.3 固定化脂肪酶YCJ01的制备 15

2.3.4 脂肪酶活力测定和蛋白浓度的测定方法 15

2.3.5 固定化过程中参数计算方法 16

2.4 结果与讨论 17

2.4.1. 介孔TiO2载体和固定化酶的外观形貌 SEM分析 17

2.4.2. 吸附时间对脂肪酶YCJ01固定化的影响 18

2.4.3. 吸附温度对脂肪酶YCJ01固定化效果的影响 19

2.5 本章小结 20

第三章 固定化脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韦手性中间体 21

3.1 前言 21

3.2 实验材料 21

3.2.1 实验试剂 21

3.2.2 实验仪器 22

3.3 实验方法 23

3.3.1. 酶法拆分N-羟甲基文斯内酰胺 23

3.3.2. N-羟甲基文斯内酰胺立体选择性转酯反应的HPLC检测 23

3.3.3. 脂肪酶立体选择性的计算 23

3.3.4. 固定化脂肪酶与脂肪酶酶粉在N-羟甲基文斯内酯拆分中的酶促反应进程 24

3.3.5. 固定化脂肪酶在N-羟甲基文斯内酯酶促拆分反应中的重复利用率 24

3.4 结果与讨论 24

3.4.1. 固定化脂肪酶与脂肪酶酶粉在N-羟甲基文斯内酯合成中的酶促反应进程 24

3.4.2. 固定化脂肪酶在N-羟甲基文斯内酯酶促拆分中的重复利用率 25

3.5 本章小结 25

第四章 结论与展望 27

4.1 结论 27

4.2 展望 27

参考文献 28

致谢 32

1. 文献综述
   1. 脂肪酶概述

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3，甘油三酰酯水解酶）是一种特殊的酶类，其能够催化三酰甘油酯水解，产生甘油、脂肪酸、甘油二酯和甘油单酯，隶属丝氨酸水解酶类。脂肪酶易于催化疏水性底物，这个特色可运用在手性药物中间体反应合成中^[1]。并且能在非水相中催化酯化反应，反应时表现出极高的区域选择性和立体选择性^[2]，因为其具有多种催化功能，所以被大量研究并应用于食品、能源、日化、医药等工业领域^[3]。

• • 1. 脂肪酶的来源

因为微生物有着品种繁多、生长迅速等特点，并且较之动物也体现出更广的pH值和底物专一性等，所以其脂肪酶有着很高的研究和商业价值。而不同来源的脂肪酶通常也会体现出不同的特异性，由此在固定时也会相应的有差异的固定化工艺要求，表1-1列出较为常用的微生物脂肪酶的最适条件，作为所运用固定化工艺条件的参考^[4]。

表1-1 各类微生物脂肪酶和其最适条件

续表1-1

• • 1. 脂肪酶的催化机理

各类脂肪酶都具有相差不大的立体结构，其活性中心都是由Ser残基与Asp、His组成的一个三元组催化中心。而中心通常被一个由一个或者多个α-螺旋构成的“盖子”掩藏，“盖子”的疏水基团与该三元组的疏水区域相结合。作用开始，盖在活性位点的结构开启，露出疏水残基和活性位点，这增长了脂肪酶的亲和力，使得底物易于通过疏水通道，与活性部位形成复合物^[5]。

• 1. 脂肪酶的固定化方法

脂肪酶的固定化，指的是运用物理、化学方法对其进行处理，使得酶与载体结合，使之不再溶于底物溶液中，由此可以限制酶在既定空间区域内依然发生酶解的方法^[6]。同游离的酶进行比较，固定化酶有着很多特点^[7]：

1. 酶极易与反应底物、产物分离，并且酶液无残留，使得后续的提纯工艺得到简化;
2. 经固定化后，许多酶的稳定性都相应的提升，可以应对工业化生产要求；
3. 酶促反应变得可控，固定化酶在反应后可回收利用，实现反复批次反应或连续反应；
4. 提高了酶使用效率，增加产物收率，降低成本等。

酶的固定化已在食品、化工、医药等行业被大量的研究与运用，在能源方面也起到了很大的作用^[8]，而对于固定化方法的研究已经进行了许多年，到如今，固定化方法大致可分为俩大类，即物理方法和化学方法^[9]，下面就不同固定化方法做一下总结与归纳。

• • 1. 吸附

吸附法是指用吸附剂和酶分子间的相互作用，将酶限定在前者上，实现酶固定化。其中有物理吸附法^[10]和离子交换吸附法^[11]。

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