论文总字数：24882字

摘 要

【目的】发掘具有甾体皂苷生物转化活性的酶，并对该酶进行克隆表达。【方法】以植物二级代谢相关的糖基转移酶特征序列PSPG为探针，以实验室已鉴定的菌库为范围，发掘具有所需功能的酶，从菌库获得野生菌并构建诱导表达重组质粒(pET28a（ ）)于大肠杆菌（DE3）中表达，并进行全细胞催化尝试。【结果】获得来源于Bacillus licheniformis具有PSPG特征序列的糖基转移酶GT-ZS-W，并实现了异源高效表达，全细胞催化尝试显示该酶没有所需催化特性。【结论】尽管理性设计了酶发掘策略，但猜测由于β-谷甾醇分子较大，无法通过该手段获得所需功能酶。然而该酶的发掘设计为类似工作提供了宝贵经验，成功表达的酶也具有非常诱人的应用潜力，有待进一步研究。

关键词：β-谷甾醇-β-D-葡萄糖苷 糖基转移酶 全细胞催化 非水相 生物转化

Abstract

【 Objective 】Exploring the enzyme with steroidal saponins biotransformation activity, and processing the cloning and the expression of the enzyme. 【Method】Using the PSPG motif(Plant Secondary Product Glycosyltransferase motif) as the probe, exploring and speculating the enzyme with the required functions from the range of identified bacteria in the laboratory. Obtaining the wild bacterium from the bacteria library, structuring and inducing recombinant plasmid (pET28a（ ）) and expressing in E.coli（DE3）, attempting whole-cell catalysis. 【Result】Obtaining the GT-ZS-W with the PSPG motif from the Bacillus licheniformis, and achieving the high-efficiency expression ,however the whole-cell catalysis showed that the enzyme was without the required functions.【Conclusion】In spite of the rational design, we can not get the required enzyme in this way. The reason may lie in the large molecular weight of β- sitosterol.

Keywords: β- sitosterol -β-D- glucoside; Glycosyltransferase; whole-cell catalysis; nonaqueous phase;biotransformation

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 2

1.1化合物的糖基化修饰研究进展 2

1.1.1酶法合成甾体皂苷 2

1.1.2 微生物转化载体皂苷 3

1.1.3 甾体皂苷生物转化机制 4

1.2. 本课题的主要研究目的与研究意义 6

第二章 微生物来源具有PSPG序列糖基转移酶的发掘 7

2.1.PSPG序列相关背景 7

2.1.1糖基转移酶1族的植物来源UDP依赖型糖基转移酶(UGTs) 7

2.1.2植物来源UDP依赖型糖基转移酶(UGTs)的重要性 7

2.1.3植物UGTs的底物专一性 8

2.2.方法 8

2.3结果与讨论 9

第三章 糖基转移酶GT-ZS1的克隆表达与催化尝试 10

3.1 实验材料 10

3.1.1 菌株与质粒 10

3.1.3 主要仪器与设备 12

3.1.4 培养基 12

3.1.5 电泳相关溶液的配制 12

3.2 实验方法 13

3.2.1 基因组的提取 13

3.2.2重组质粒pET-28a-gtzs1的构建 14

3.2.3重组菌E.coliBL21（DE3）/pET-28a-gtzs1的表达 16

3.2.4 表达产物SDS-PAGE电泳 16

3.2.5 β-谷甾醇的全细胞催化 17

3.2.6. 底物及产物HPLC检测 17

3.3结果与讨论 18

3.3.1GT-ZS1基因的克隆与异源表达 18

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 22

参 考 文 献(References) 22

致 谢 28

第一章 文献综述

我国具有大量药理活性的植物资源，其中含有甾体皂苷类的植物占了很大比例，甾体皂苷(Steroidal saponins)是一类重要的中药活性成分，依据F环的环合状态分为呋甾皂苷(Furostanol saponin)和螺甾皂苷(spirostanol saponin)两种类型，是合成激素及其他重要天然药物的重要原料，具有抗癌、治疗心血管疾病、调节免疫等多方面的生理活性[1-3]。因此，已有众多研究者关注甾体皂苷的化学与生物活性，探索更多途径以扩充甾体皂苷的化合物库及其具有药理活性的先导物的种类。

在糖苷类化合物的结构中，糖基部分明显影响着糖苷类药物的药理活性，前体药物分子经过糖基化结构修饰后，前体药物的性状特征出现了重要的变化。通过提高溶解性、调节血浆半衰期以及增加与作用位点结合的特异性，糖基部分可以对母体的药理活性进行一定的优化。糖基化后的药物药理活性由于糖苷基团会出现较明显的改变，但是糖类分子通常为多羟基结构，α、β两种糖苷键，有的还包含有氨基,因而使得引入糖基成为了一个比较复杂的问题。目前用以得到糖苷化合物有两种主流方法，分别为化学合成和酶促反应。化学合成法可以部分解决活性单体来源问题，但是对于多活性位点的天然化合物的合成则存在选择性低、步骤繁多复杂、产生较大污染等局限。而生物酶法合成以其高区域选择性和立体选择性以及特异性高、环保低毒性、条件温和等特点在解决部分多活性位点的天然化合物的制备问题上显示出独特的优势。通过糖基转移酶能够选择性地合成所需的化合物，而且不需要保护脱保护等等繁琐复杂的步骤，因此在合成糖苷类化合物中有着较为普遍的应用。

1.1化合物的糖基化修饰研究进展

1.1.1酶法合成甾体皂苷

随着生物技术的不断发展和对甾体皂苷转化的持续深入研究，已经有研究者从猪肝脏、微生物中分离纯化得到关键的糖苷酶，或者通过基因重组技术得到活性高的重组酶，这些糖苷酶能够选择性地水解部分糖基以生成相应的次级皂苷或直接生成皂苷元[4]。Qian[5]等在猪肝脏找到一种β-葡萄糖苷酶，该酶具有很高的表达量，并将其应用于穿山龙药材中的薯蓣皂苷的催化，获得了酶解产物3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-薯蓣皂苷元的单体，这种酶解方法产物纯度较高，具有良好的效益。另一种从Absidiasp.d38中分离出的薯蓣皂苷-糖苷酶[6]，可以依次水解薯蓣皂苷C-3位的α-L-鼠,李糖（与β-D-葡萄糖1,4连接）、α-L-鼠李糖（与β-D-葡萄,糖1,2连接）、β-D-葡萄糖至薯蓣皂苷,元。马百平[7]等将2种酶作为级联反应体系能够水解甾体皂苷的糖基，将盾叶薯蓣中的主要皂苷--盾叶新苷和三角叶皂苷完全水解为三角叶皂苷元，将黄姜总皂苷转化为皂苷元时转化率能达到90%左右。从烟曲霉分离得到的β-葡萄糖苷酶能转化盾叶薯蓣中多种螺甾皂苷（如薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元-双葡萄糖苷、延龄草苷、三角叶皂苷和纤细薯蓣皂苷），最终生成薯蓣皂苷元[8]。上述研究进展为实现酶法转化载体皂苷奠定了一定的基础。

1.1.2 微生物转化载体皂苷

微生物转化法中，碳源的获取是直接利用药材中的纤维素和淀粉，氮源是含氮的有机化合物，不需要加入另外的碳源和氮源，有反应条件温和、没有污染、成本较低等诸多优点。已有许多研究报道了通过微生物法将甾体皂苷类成分转化得到次级皂苷和薯蓣皂苷元。比如对于盾叶薯蓣中的皂苷类成分，有研究利用米曲霉、哈茨木霉作为发酵菌株进行转化，由于两种二者产生酶系不同，所以两种微生物有不同的转化途径，得到转化中间产物的种类及终产物的产率也有所差异[9-14]。张佳佳等[15]首次筛选到一株赤霉菌（GibberellaintermediaWX12，层出镰孢菌的有性阶段）也能够转化黄姜皂苷，经过优化反应条件，薯蓣皂苷元得率提高3倍，实现了目标化合物的高效转化。选用里氏木霉作为转化菌株，通,过其与盾叶薯蓣原药材的共,发酵过程，甾体皂苷C-3位上连接,的β-D-葡萄糖或α-L-鼠李糖均,被降解，薯蓣皂苷元的产率较从原药材中直接提取高出42.4%[16]。也有一些研究发现，微生物法不仅可以提升转薯蓣皂苷元的获得率，还能够获得其他的多种甾体皂苷衍生物。Zhang[17]等也利用米曲霉对穿,龙薯蓣药材进行转化尝试，分离纯化所得产物后通过NMR、MS等技术手段进行结构鉴定，发现产物中有8种已知的甾体皂苷和两种新的甾体皂苷化类合物，分别为薯蓣皂苷E:25(R)-spirost-5-en-21β-methyl-3β-ol-3-O-α-L-rhamnopyra-nosyl-(1-4)-β-D-glucopyranoside和薯蓣皂苷F:(25R)-spirost-5-en-3β-ol-7-one3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-β-D-gl-ucopyranoside。此外，有些植物病原微生物的代谢产物中发现了同植物中结构相同的甾体皂苷，如一种灰霉病真菌（BotrytiscinereaPers.Fr.）以甾体皂,苷生物碱为底物进行生物转化，经LC-MS把病原菌菌的代谢物与感染该病原菌的百合组织中的成分比较分析，发现在Botrytiscinerea的代谢物中存在百合中的天然甾体皂苷生物碱(22R,25R)-spirosol-5-en-3β-ylO-R-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside[18]。

1.1.3 甾体皂苷生物转化机制

1.1.3.1 羟化反应

在碳氢化合物中，非活泼C-H键的羟基化是一种十分主,要的化学反应，在传统有机化学合成中基本上无法,进行的羟基化反应能够通过微生物转化实现。比如一些微生物能实现甾体皂苷母核的任意位点羟基化，但是除了在C-17位，化学合成法难以在其他位置再引入羟基。大部分皂苷的羟基化反应在甾体母核上进行，并且可以在多个位置引入羟基。利用这种转化修饰，不少化合物原本的药理活性发生了改变或提高。Patrice等[19]应用尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、奇异长喙壳菌（Ceratocystisparadoxa）和甄氏外瓶霉菌（Exophiala jeanselmei）对11种甾体类化合物进行了生物转化研究，通过产物结构分析，它们中Fusariumoxysporum和Exophiala jeanselmei具有对底物的母核结构羟基化转化修饰的能力，对于C-15和C-7位的羟基化前者有明显的能力，后者对14α和5α位的羟基化能力十分客观。来源于土壤分离的放线菌IBL-14（Streptomycesvirginiae）能实现叔碳羟基化，在薯蓣皂苷元F环的C-25位置上引入羟基，使其转化成为异纽替皂苷元 [20]。

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