论文总字数：18677字

摘 要

背景：LC-MS/MS作为药物分析的一个很重要的方法，被越来越多地用于血清、尿液等中内源性类固醇激素二氢睾酮的分析测定。该方法有着较高的灵敏度，较好的选择性和特异性，广泛用于生物样本中低浓度化合物的定性确认和定量测定。我的课题是对LC-MS/MS检测血清中DHT进行方法学考证，DHT与体内诸多疾病的发生和组织的正常生理功能都有很密切的联系,建立准确而灵敏的血清样品中DHT含量检测方法具有很深远的实际意义。

目的：通过使用反相色谱柱对激素样本进行分离，使用质谱对激素样本进行检测，并且对流动相的组成、洗脱梯度等液相参数以及子母离子对，色谱柱等质谱条件进行优化，建立血清样品中DHT的LC-MS/MS检测方法，之后再进行方法学研究，以期建立可靠，有效，灵敏度高，精密度好，能够满足血清中二氢睾酮定量分析需求的方法。

方法：取200 μL血清样品，先用葡萄糖醛酸糖苷酶酶解，再用甲基叔丁基醚萃取后进行样品分析，以睾酮-d3作为内标。采用Kromasil C18色谱柱 (2.1×150mm 5μm)，乙腈—纯水（含0.1%乙酸）为流动相，梯度洗脱，流速0.30mL/min，柱温40°C，进样量6 μL。在ESI源正离子模式下，选择多反应监测（MRM）模式。经检测，二氢睾酮和内标的检测离子对分别为：m/z 291.2→255.4和m/z 292.0→109.3。其后配置一批样品对检测方法特异性、精密度与准确度、线性和定量范围、定量下限、样品稳定性、提取回收率等进行考察，来确定检测方法是否可靠。

关键词：血浆 方法学研究 二氢睾酮 内源性类固醇激素

Establishment of analytical method for determination of dihydrotestosterone by LC-MS/MS

Abstract

Background：As a very important method of LC-MS / MS analysis of drugs,it is increasingly being used in serum, urine and other endogenous steroid hormone dihydrotestosterone analysis and detection. This method has a high sensitivity, high selectivity and good specificity and can be used to confirm the qualitative and quantitative determination of biological samples of low concentration of the compound. In this study, the LC-MS / MS analysis applied to endogenous serum steroid hormone dihydrotestosterone, optimization Chromatography with Mass Spectrometry conditions,and established a new method of LC-MS / MS, this method allows more precise and sensitive detection of serum samples Erqing testosterone.

Purpose：By using reverse phase column of hormone samples separation，using a triple quadrupole mass spectrometry hormone samples for testing, and optimizing the composition of the mobile phase gradient elution liquid parameters,establishing the method of detection of MS parameters steroid hormone dihydrotestosterone by LC-MS / MS, and researching Methodology，in order to establish a reliable, effective, high sensitivity, good precision, to meet in the serum DHT quantitative analysis needs.

Methods:200μL serum samples were treated with β-Glucuronidase for hydrolysis and used methy tert-butyl ether extraction. T-d3 was selected as internal standard. Chromatographic separation was preformed by Kromasil C18 column (2.1×150mm 5μm) using mobile phase consisted of acetonitrile and water containing 0.1% acetic acid. The column temperature was 40°C. The mobile phase flow rate was maintained at 0.3 mL/min and the injection volume was 6μL. Mass spectrometric detection in positive ion electrospray mode was performed by multiple reaction monitoring (MRM). The transition monitored were m/z 291.2→255.4 for Dihydrotestosterone

and m/z 292.0→109.3 for IS, respectively. The analytic methodology was evaluated by detecting the specificity, calibration curvestability,lower limit of quantitation linearity,precision and accuracy, stability,recovery and matrix effects.

Key Words: plasma;methodology research; dihydrotestosterone; endogenous steroids

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1二氢睾酮的化学成分 1

1.2二氢睾酮的药理学作用 1

1.2.1对大鼠坐骨神经的影响 1

1.2.2对大鼠血脂代谢的影响 2

1.2.3对人体神经系统的作用 2

1.2.4对血小板激活和细胞内钙离子浓度调节的作用 2

1.3二氢睾酮的应用 3

1.4现代分析技术在体内药物分析的应用 3

1.4.1体内药物分析的特点 3

1.5 药物分析方法学的验证 4

第二章 材料和方法 5

2.1前言 5

2.2.1主要试剂 5

2.2.2主要仪器 5

2.2.3 线性关系考察 9

2.3.4 提取回收率与基质效应 10

2.3.5 血清样品在各储存条件下的稳定性 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 方法学结果 12

3.2 讨论 12

3.2.1 样品前处理 12

3.2.2 质谱条件优化 12

3.2.3 色谱条件优化 13

3.3 实验小结 13

第四章 结论 14

参考文献 15

致谢 17

文献综述

二氢睾酮是一种类固醇激素，也是雄激素的一种，对维持第二性征、蛋白质合成和生殖系统发育有重要作用，其能刺激神经元的分化、促进神经元的存活、增加突触的密度和轴突的再生，也是一种具有神经活性的物质,从而发挥脑神经保护作用^[1]。雄激素对脑神经的保护已经被对面神经^[2]和坐骨神经^[3]的实验证实了，只是对视神经再生的作用和机制，目前还停留在大鼠研究的层面。由于二氢睾酮与多种疾病（例如雄激素秃发，前列腺癌）都有紧密的联系，因此建立一种有效检测人血浆中二氢睾酮浓度的方法无论是对学术研究还是相关疾病的研究都有很深刻的意义，我的论文研究旨在应用LC-MS/MS技术建立灵敏准确地方法检测人血浆中二氢睾酮的血浆浓度。

1.1二氢睾酮的化学成分

二氢睾酮，亦称雄烷酮，系统命名法又称17β－羟基-5α-雄[甾]烷-3-酮，英文名dihydrotestosterone，简称DHT，对附属性腺如前列腺、精囊腺等，发挥雄激素类似的效用。在附属性腺中，睾酮在5α处的双键被5α-氢化酶还原生成一种甾醇，特异性作用于细胞内相应的受体，在细胞核中发挥作用，促进新蛋白质合成，其雄性激素效用比睾酮稍强，发挥作用后由3α-羟基甾醇脱氢酶代谢成5α-雄烷-3α－17β-二醇随后被排出体外。

1.2二氢睾酮的药理学作用

1.2.1对大鼠坐骨神经的影响

近年来发现在细胞培养中雄激素能促进神经细胞轴突的生长，NSC34/mAR 细胞研究DHT对促进运动神经元分化的影响^[6]，细胞受到DHT的作用后，轴突生长用计数神经元呈阳性SMI312的数目来检测。DHT加速了NSC34/mAR 细胞的轴突化过程，DHT是雄性动物体内最主要的雄激素之一，其结构与睾酮近似又有很明显的不同。DHT和T均能与结构一样的雄激素受体结合，可能表现出近似，也可能表现不同的生理反应。最近有研究发现，坐骨神经上也可能存在雄激素的受体，但其上表现雄激素受体作用的具体细胞仍然未被发现。在激活或抑制的基因中，应用雄激素后主要是Neuritin基因被雄激素上调，此外，树突的急剧生长也与Neuritin基因的表达相关，其的作用有协调发展树突和轴突，促进突触的成熟。

1.2.2对大鼠血脂代谢的影响

雄激素水平随着男性年龄的增长而降低 ,心血管事件发病几率增大和脂质代谢异常也会伴随出现^[7]。在现有的研究中,前列腺癌去势治疗和性腺功能减退患者血清中总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG )低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等小分子化合物的含量都会增高^[8],虽然老年男性用睾酮替代治疗能够有效降低血清中TC、LDL-C^[9]的含量，但进一步研究发现在组织中睾酮是先转化为二氢睾酮 (DHT)而后才发挥生理作用得，但至今为止有关DHT对血脂代谢的影响还未见报道。在国内，国人男性脂肪肝的发病率为33.22%，远高于女性的7.84%,而男性脂肪肝，脂代谢和DHT的关系与年龄的关系还未见报道。流行病学调查显示,男性心血管疾病发病率与绝经前同年龄段的女性相比明显偏高,即使排除掉其他的危险发病因素,仅“男性”也可以算得上是一个独立的危险因素。雄激素在体内的睾丸间质细胞内由胆固醇合成,睾酮是其主要合成原料，在靶器官内由5α- 还原酶还原为二氢睾酮（DHT)发挥其生理作用，只有游离状态下的睾酮才具有生物活性,如果其在血浆中与激素结合蛋白和白蛋白结合, 会失去活性。目前得研究认为:生理水平的雄激素对男性动脉粥样硬化 (AS)有良性或中性的影响,其有脂蛋白和非脂蛋白介导两种途径 , 但研究还表明雄激素对血脂的作用可能存在抗动脉粥样硬化的作用。

1.2.3对人体神经系统的作用

雄激素对脑神经保护作用的相关研究表明，在神经再生微环境的多个方面雄激素都存在着影响，既对神经营养因子的表达有积极作用^［10-11］、又对神经胶质瘢痕的产生有好的影响^[12]、还助于抑制神经细胞凋亡基因的表达^［13-14］，除此之外对增加神经元的抗氧化能力也有很大的益处^［15］，作为一种神经保护性药物是很有潜能的。研究发现，二氢睾酮在神经损伤后可以有效地促进 RGC-5神经突起的再生。研究还发现，实验中氧糖剥夺／复氧损伤操作后， 检测发现RhoA 表达增加，而Neuritin表达减少；二氢睾酮干预后，检测发现RhoA 表达下调，而 Neuritin 表达上调，这些现象表明雄激素对神经细胞神经营养因子表达的增加， 神经再生抑制性物质生成的抑制可能就是雄激素的作用原理^［16］。

1.2.4对血小板激活和细胞内钙离子浓度调节的作用

大家都知道男女间血栓的形成存在差异，而血栓的形成与血小板的功有关，血小板受性激素的影响已被证实，而血小板与血栓形成的性别差异有关还未被证实。给健康男性自愿者外源性地补充睾酮会导致血小板血栓素A受体的上调，血小板对TXA类似物(I—BOP)的反应的增强也已经被观测到，还有研究表明血栓性心血管疾病与雄激素滥用也相关。然而，与此相反的是，Smith等人的研究表明，男性雄激素替换治疗具有心血管益处，而对凝血过程并没有负性调节作用，这新的发现又表明合适剂量雄激素的补充有益于低雄激素血症患者的治疗。到现今的发现为止，生理剂量的雄激素调节血小板激活的作用还没有有力的佐证。已有的理论表明，钙离子浓度在血小板的激活机制中扮演了重要的角色，ADP激发血小板致密体中的钙离子快速释放到胞浆，随后钙调蛋白受到钙离子的作用，从而促进血小板聚集完成凝血。

1.3二氢睾酮的应用

人为地降低5α- 还原酶的活性抑制睾酮转化为二氢睾酮的过程，通过这样的调节使前列腺组织中的DHT维持在正常水平，从而预防包括良性前列腺肥大在内的一类前列腺疾病，锯齿棕和何首乌中存在一种具有活性的脂质体成分，该脂质体可以向前列腺组织中的前列腺特异抗原释放二氢睾酮阻滞剂，同时还可以与一种特异的氨基酸识别序列相结合，防止DHT阻滞剂在体内降解。此外，该脂质体在前列腺中能够缓释活性成分，延长它的作用时间。

1.4现代分析技术在体内药物分析的应用

1.4.1体内药物分析的特点

杂质干扰多；采集条件要求各异性强；样品量少，不易重新获得;专属性和灵敏度要求高;药物和代谢产物浓度低;测定方法要求简便，迅速，重现性好;需要进行前处理且工作量大;生物样品不易长期保存，需要尽快测定。

1.4.2生物样品的前处理过程

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