论文总字数：16792字

摘 要

β-半乳糖苷酶是一类能够将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖的酶,可以用来降低乳制品中的乳糖含量。它同时还具有半乳糖苷转移作用，可用于生产低聚半乳糖，从而被广泛应用于益生菌食品生产中。

通过重叠PCR技术，分别克隆出两个活性位点的突变基因。将PCR产物及质粒双酶切后连接，成功构建了表达载体。再得到重组质粒pET-gal，将重组质粒pET-gal转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到突变菌株Ala166、Ala364，用Kan抗性筛选阳性克隆，挑选含有目的质粒的单克隆，提取质粒，测序，克隆得到的半乳糖苷酶基因全长1386 bp。采用Vector NTI进行序列分析，相应位点均发生突变，说明突变体构建成功。

本实验通过序列比对推测出β-半乳糖苷酶活性中心分别为166和364位的两个谷氨酸。

然后设计了两个半乳糖苷酶YZ01的突变体，将活性中心的两个氨基酸分别突变为丙氨酸。

实现了突变酶在大肠杆菌BL21中的可溶性表达，但检测不到突变酶的酶活，验证该半乳糖苷酶推测的活性中心氨基酸残基。

关键词：β-半乳糖苷酶 活性中心 PCR

Study of a novel YZ01 galactosidase’s activity amino acid

Abstract

β-galactosidase is one of enzymes which can hydrolysis of lactose into glucose and galactose，and it also can be used to reduce the lactose content in dairy products . It also has the effect of transferring galactosidase which can be usdr for producting galacto-oligosaccharides and be widely applied in the production of probiotic foods .

By overlapping PCR, we can clone the mutated gene’s two active sites. And the products of PCR were digested plasmids and connect successfully constructed expression vector. Then we can recieve the recombinant plasmid pET-gal, and transformed the plasmid pET-gal coli into E.coli BL21 (DE3) ,so can obtain mutant strains Ala166, Ala364.The positive clones were screened by Kan resistance , plasmid and sequenced galactosidase gene which obtained full length clones 1386 bp. Vector NTI sequence analysis is using for the corresponding sites mutated , indicating that the mutant was successfully constructed.

In this study, by sequence alignment,we can speculate that β-glucosidase’s activity center were two glutamic acid in166 and 364 bit.And then design two mutant YZ01 galactosidase , the two amino acids in the active center were mutated to alanine . Achieve a mutant enzyme expressed in E.coli BL21 in a soluble , but the mutant enzyme activity is not detected , that can verify that the presumed galactosidase amino acid residues in the active center .

Key Words: β-galactosidase active center PCR

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 β-半乳糖苷酶的概述 1

1.1.1 β-半乳糖苷酶的性质 1

1.1.2 β-半乳糖苷酶的来源 1

1.1.3 β-半乳糖苷酶的催化机理 2

1.2 β-半乳糖苷酶的应用 3

1.2.1 β-半乳糖苷酶在食品行业中的应用 3

1.2.2 β-半乳糖苷酶在制药工业中的应用 3

1.2.3 β-半乳糖苷酶基因在基因工程中的应用 4

1.2.4 β-半乳糖苷酶在实验室的应用 4

1.3 β-半乳糖苷酶的研究概况 4

1.4 GH1家族半乳糖苷酶活性中心分析 4

1.5 研究的目的及意义 5

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株与质粒 7

2.1.2 主要试剂 7

2.1.3 实验仪器 8

2.1.4 培养基 9

2.1.5电泳相关溶液的配制 9

2.2 实验方法 10

2.2.1 β-半乳糖苷酶YZ01的活性氨基酸分析 10

2.2.2 β-半乳糖苷酶基因组的提取 10

2.2.3 设计引物 10

2.2.4 重叠PCR 11

2.2.5 双酶切反应体系 11

2.2.6 大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞的制备 13

2.2.7 大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的转化 13

2.2.8 菌落PCR鉴定阳性重组子 14

2.2.9 β-半乳糖苷酶的诱导表达 14

2.2.10 SDS-PAGE分析和酶活检测 15

第三章 结果与讨论 17

3.1 β-半乳糖苷酶YZ01序列比对分析 17

3.2 β-半乳糖苷酶突变体的构建 17

3.3 β-半乳糖苷酶突变体表达及酶活测定 18

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

第一章 文献综述

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3.2.1.23)是一类能够将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖的酶,可以用来降低乳制品中的乳糖含量。它同时还具有半乳糖苷转移作用，可用于生产低聚半乳糖，从而被广泛应用于益生菌食品生产中。

1.1 β-半乳糖苷酶的概述

1.1.1 β-半乳糖苷酶的性质

β-半乳糖苷酶是由β-半乳糖苷酶基因(Lac Z基因)编码，是4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖分解为1分子葡萄糖和1分子半乳糖。从不同物种中提取的β-半乳糖苷酶蛋白质序列有着很高的相似性和同源性。β-半乳糖苷酶的分子质量一般在100-850ku之间，其中由大肠杆菌得到的β-半乳糖苷酶分子质量最大，大约为520-850ku^[1-2]。

目前，已经有多种不同来源的β-半乳糖苷酶基因可以被克隆。1969年，Beckwith博士为首的研究小组，运用DNA分子杂交技术首次成功分离得到β-半乳糖苷酶基因。1983年Kalnins博士等获得了3.7kb的大肠杆菌来源的β-半乳糖苷酶基因全序列，其编码有1023个氨基酸残基，蛋白分子质量为116.353（单个亚基）。1989年Schmidt教授等获得了保加利亚乳杆菌制取的β-半乳糖苷酶基因全核苷酸序列，该段基因长3.024kb，比大肠杆菌的Lac Z基因稍短一些，但是基因产物却非常相似^[3]。

1.1.2 β-半乳糖苷酶的来源

β-半乳糖苷酶存在于植物，细菌，真菌，放线菌以及哺乳动物的肠道中心。其中细菌中的乳酸菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、产气肠细菌等; 霉菌中的米曲霉、黑曲霉、炭色曲霉等; 酵母中的脆壁克鲁维酵母和热带假丝酵母等; 放线菌中的天蓝色链霉菌等都可以产β-半乳糖昔酶。因此目前只有来源于微生物发酵产生的β-半乳糖苷酶有一定的工业应用价值，利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶，具有酶源丰富，生产成本低，产量高，而且不受地理位置、季节等一些因素的影响等一些优点^[4]。

1.1.3 β-半乳糖苷酶的催化机理

β-半乳糖苷酶

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