论文总字数：21064字

摘 要

本论文是通过组织培养和收集、RNA提取、cDNA合成、qRT-PCR检测和内参筛选的方式进行肺癌基因和胃癌基因的研究。从论文数据分析结果得出几点结论：1、基因GAPDH在所有基因中最不稳定；2、在胃癌中最稳定的三个基因依次是IPO8、MRPL19和ESD；3、在肺癌中最稳定的三个基因依次是MRPL19、ESD和IPO8，而大部分基因是不稳定的。 用这种方法分析基因的稳定性、筛选基因，为实验提供了保障，通过几种方法的分析最终得出最稳定的三个基因IPO8、MRPL19和ESD可以作为筛选其他基因的对照基因。

关键词：肿瘤基因 内参基因 qRT-PCR RNA

Tumor gene expression screening to detect internal reference genes

Abstract

This paper through collected and tissue culture, RNA extraction, cDNA synthesis, genetic studies of lung cancer and stomach cancer gene testing and internal reference qRT-PCR screening approach. Data analysis results obtained from the papers conclusions: 1, the most unstable of all gene GAPDH gene; 2, the most stable in gastric cancer gene followed by three IPO8, MRPL19 and ESD; 3, the most stable in lung cancer followed by three gene MRPL19, ESD and IPO8, and most genes is unstable. In this way the stability analysis of genes, genetic screening, provide a guarantee for the experiment, several methods by analyzing the final results of the most stable of the three genes IPO8, MRPL19 and ESD can be used as a screening other genes control gene.

Key Words:Tumor gene Reference gene PCR technology RNA

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 肿瘤个体化治疗 1

1.1.1 肿瘤个体化治疗 1

1.1.2 生物标志物 1

1.1.2.1 生物标志物概念 1

1.1.2.2 生物标志物分类 1

1.2 基因表达检测 2

1.2.1 基因表达检测的目的 2

1.2.2 基因表达检测的方法 2

1.2.2.1 高通量基因表达检测 2

1.2.2.2 普通基因表达检测 3

1.3 内参基因的稳定性 3

1.3.1 荧光定量PCR 3

1.3.1.1 基于染料的荧光定量PCR 4

1.3.1.2 基于探针的荧光定量PCR 4

1.3.2 内参基因 5

1.3.2.1 常见的内参基因 5

1.3.2.2 软件的应用 7

1.4 本设计研究的内容 7

第二章 材料与方法 9

2.1 组织收集 9

2.2 RNA提取 9

2.3 cDNA合成 10

2.4 qRT-PCR检测 11

2.5 内参筛选 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 GeNorm软件分析结果 13

3.2 NormFinder软件分析结果 14

3.3 Delta Ct 数据分析结果 15

3.4 肺癌内参基因数据总体分析 16

3.5 胃癌内参基因数据总体分析 17

第四章 结论 18

参考文献 19

致谢 21

第一章 前 言

1.1 肿瘤个体化治疗

1.1.1 肿瘤个体化治疗

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。

监测还显示中国癌症发病地域分布明显，肺癌和胃癌高发区主要集中在西北及沿海各省，如上海、江苏等长三角地区以及甘肃、青海等较为突出。所以本研究主要以研究肺癌和胃癌基因为主，为治疗胃癌和肺癌提供一定的个性化治疗方向。

1.1.2 生物标志物

1.1.2.1 生物标志物概念

在亚个体和个体水平上既可以测定污染物暴露水平，也可以测定污染物效应的生理和生化指标。对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理、病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。

生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平（分子、细胞、个体等）上因受环境污染物影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化、可以是某一生化代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现，可以是个体表现出的异常现象，可以是种群或群落的异常变化，也可以是生态系统的异常变化。

1.1.2.2 生物标志物分类

从功能上一般分为：接触（暴露）生物标志物（biomarker of exposure）；效应生物标志物（biomarker of effect）；敏感性生物标志物（biomarker of susceptibility）。

1.2 基因表达检测

1.2.1 基因表达检测的目的

癌症发生的机制非常复杂，对于不同癌症甚至患有相同癌症的患者，导致癌症发生的分子机制和组织病理通路都不尽相同。临床医生在肿瘤治疗中发现，人体肿瘤千差万别，即使是同一个部位的肿瘤，治疗效果和方法也应因人而异，这种因人、因病而采取的不同疾病治疗方法称为“个体化治疗”。因此在癌症治疗过程中，只有同病异治，因人而异，实施个体化治疗，才能针对不同类型的病人选择合适他们的药物。

随着基因分子水平研究的不断深入，越来越多的肿瘤细胞信号通路被发现，大量临床研究表明，通路中的特定基因的扩增、突变、表达状态与靶向、化疗药物的有效性密切相关。因此，临床上检测这些通路中特定基因的扩增、突变、表达情况，能针对性地为每位患者“量身”定做一套最适合的治疗方案，从而最大程度地提高治疗的有效率，减少药物的毒副作用，避免用药不当贻误治疗时机。

1.2.2 基因表达检测的方法

基因表达分析，是内参基因筛选的的重要工具。目前，用于基因表达分析的方法主要包括：Northern Blot、RPA(ribonuclease protection assays)、qRT-PCR(quantitative real-time PCR)、PCR阵列(PCR microarray)和微阵列(microarray)等^[1]。在此用到的手段是qRT-PCR，逆转录定量PCR（qRT-PCR），是一种应用广泛的研究基因表达模式的方法，尤其是在样品量少或者说非常珍贵的时候。这种方法主要的优点是范围宽、敏感性高、精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，且产出率高，可以进行多重检测等。

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