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1,4,7-三氮杂环壬烷盐酸盐的合成研究

67/68镓标记剂，通过亲本低分子量多肽的溶酶体蛋白水解释放的67/68镓-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸-蛋氨酸，以降低肾放射性水平。

Tomoya Uehara,* Takemi Rokugawa, Mai Kinoshita, Souki Nemoto, Guerra Gomez Fransisco Lazaro,Hirofumi Hanaoka, and Yasushi Arano

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University, 1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba 55263-8675, Japan

摘要：：镓-67或镓-68（^67/68Ga）标记的低分子量（LMW）探针（例如肽和抗体片段）的肾脏定位在靶向成像中一直是个难题。Wu等人先前的研究表明，⁶⁷Ga标记的S-2-（4-异硫氰酸苯基）-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（SCN-Bz-NOTA）-共轭蛋氨酸（⁶⁷Ga-NOTA-Met），在亲本⁶⁷Ga-NOTA-Bz-S CN二硫化物稳定的Fv抗体片段的溶酶体蛋白水解后迅速从尿液中的肾脏排出（Bioconjugate Chem.，（1997）8，365minus;369)。

在本研究中，设计、合成了一种新的^67/68Ga标记试剂，用于LMW探针，可释放^67/68Ga-NOTA-Met，并使用寿命较长的⁶⁷Ga进行评估，以降低肾脏放射性水平。我们采用甲硫氨酸-异亮氨酸（MI）二肽键作为可切割的连接部分。将MI的胺基残基与SCN-Bz-NOTA偶联用于⁶⁷Ga标记，将MI的羧酸残基衍生为马来酰亚胺用于抗体偶联以合成NOTA-MI-Mal。将抗原癌基因人类表皮生长因子受体2（Her2）抗体的抗原结合（Fab）片段与亚氨基噻吩硫基化，通过马来酰亚胺-巯基化学将NOTA-MI-Mal与抗体片段结合。Fab片段也与SCN-Bz-NOTA（NOTA-Fab）结合以进行比较。⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab以95%以上的放射化学产率获得，并在小鼠血清中稳定24小时。在使用正常小鼠进行的生物分布研究中，⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab在注射后1至6小时的肾放射性水平显著低于⁶⁷Ga-NOTA-Fab。对注射⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab后6小时获得的尿样的分析表明，大多数放射性物质以⁶⁷Ga-NOTA-Met的形式排出。在使用荷瘤小鼠进行的生物分布研究中，⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab的肿瘤与肾脏的比率（注射后6小时）是⁶⁷Ga-NOTA-Fab的4倍。尽管还需要进一步的研究，包括放射性同位素的结构和/或可切割的键，但本研究的结果表明，目前的化学设计适用于开发用于低肾放射性水平的⁶⁷Ga标记Fabs。

导言

镓放射性同位素在分子成像中是热点问题。镓-67（⁶⁷Ga）是一种gamma;-发射体（半衰期：3.3 d），目前用于通过SPECT诊断感染和炎症过程以及肿瘤成像。1,2镓-68（⁶⁸Ga）是一种PET放射性同位素，从长寿命的⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器系统中获得，允许迄今为止潜在的成本效益生产⁶⁸Ga放射性示踪剂远离回旋加速器设施。³其67.7分钟的物理半衰期适用于用快速药理学标记低分子量（LMW）探针，如小肽和抗体片段。^3minus;6为了制备^67/68Ga标记的LMW探针，双功能螯合剂与LMW探针结合，接着是⁶⁷/⁶⁸Ga与共轭物的络合反应。在迄今为止报道的各种双功能螯合剂中，由于在温和的反应条件下形成稳定的镓络合物，因此优选使用大环螯合剂1,4,7-三氮杂环壬烷 N-N′-NPrime;-三乙酸（NOTA）。^3minus;6

放射性标记LMW探针允许在靶组织中快速靶向且均匀分布，^7,8然而，LMW探针的使用，特别是那些标记有金属放射性核素的探针，与肾脏中的高持续放射性水平有关，这影响了肾脏附近靶点的显示。^8，9以前的研究表明，放射性标记的抗体片段在肾小球滤过后通过管腔内吞作用被近曲小管重新吸收。肾放射性水平的持久性可归因于肾细胞中放射性标记抗体片段的溶酶体蛋白水解后产生的放射性抗体的长时间滞留。^10minus;13这些发现表明放射性抗体的活体行为在肾放射性水平中起着关键作用，而且通过从肾脏快速排出尿液释放放射性代谢物

亲代^67/68Ga标记的LMW探针在溶酶体降解后可能有助于降低肾放射性水平。

图1. Ga-NOTA-Met（A）和Ga-NOTA-Lys（B）的结构。

图1. Ga-NOTA-Met（A）和Ga-NOTA-Lys（B）的结构

使用溶酶体酶、酯键或二酯键切割的可代谢连接体的方法已被用作可代谢连接体。^10minus;14然而，酯键作为可代谢连接体的稳定性取决于探针的分子大小，因此还需要开发血浆稳定的可代谢连接体LMW探针。¹⁵此外，很少有研究检测使用大环螯合物的放射性标记试剂，大环螯合物释放放射性同位素，这些放射性同位素设计用于在母体放射性标记LMW探针溶酶体降解后从肾脏在尿液中快速排泄。

Wu等人先前报道，当使用2-（磷 -异硫氰酸苯）-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（SCN-Bz-NOTA）作为双功能螯合剂施用⁶⁷Ga标记的二硫键稳定Fv抗体（dsFv）的二硫键连接Fv片段时，蛋氨酸的⁶⁷Ga-NOTA-Bz-SCN加合物（⁶⁷Ga-NOTA-Met，图1）和蛋氨酸的⁶⁷Ga-NOTA-Bz-SCN加合物赖氨酸（⁶⁷Ga-NOTA-Lys，图1）作为放射性代谢产物在肾脏中生成，因为dsFv的N末端氨基酸是蛋氨酸。¹²本研究还表明，前者在小鼠肾脏中的停留时间明显短于后者。这些结果表明，^67/68Ga标记的LMW探针试剂在溶酶体中母体化合物的蛋白水解后释放^67/68Ga-NOTA-Met可能有助于降低注射Ga标记的LMW探针后的肾放射性水平。由于Wu等人使用的dsFv轻链N端的第二个氨基酸是异亮氨酸（Ile），因此设计了16-甲基-马来酰亚胺（NOTA-MI-Mal，图2），合成了与单抗的Fab片段结合用2处理抗体片段后的Her2-亚氨基噻吩（NOTA-MI-Fab）。在这个分子设计中，当Ga标记的NOTA-MI-Fab（Ga-NOTA-MI-Fab）中蛋氨酸和异亮氨酸之间的肽键被裂解时，Ga-NOTA-Met从结合物中释放出来。比较了注射Ga-NOTA-MI-Fab和Ga-NOTA-SCN结合Fab片段（Ga-NOTA-Fab）。对LMW探针的新Ga标记试剂NOTA-MI-Mal降低肾脏放射性水平的有效性进行了评估。

图2. NOTA-MI-Mal的结构

结果

制备NOTA-MI-Fab和NOTA-Fab（方案1).

通过使SCN-Bz-NOTA与Met-Ile-Mal反应合成NOTA-MI-Mal。 Fab与NOTA-MI-Mal的偶联是通过马来酰亚胺-硫醇化学方法进行的，使用的是通过添加2-IT生成的硫醇基。通过在缀合反应之前和之后测量Fab片段的巯基，估计每分子Fab引入的NOTA-MI的数目为0.75-0.9。SCN-Bz-NOTA与Fab片段的缀合是通过使异硫氰酸酯与Fab片段的伯胺残基反应来实现的。用67Ga标记的未纯化的NOTA-Fab共轭物，然后通过薄层色谱分析，估计每分子Fab附着的SCN-Bz NOTA数为1.0。

⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab和⁶⁷Ga-NOTA-Fab的制备。

NOTA-MI-Fab和NOTA-Fab都在醋酸盐存在下对⁶⁷Ga和所得化合物进行TLC、CAE和SE-HPLC分析。两种⁶⁷Ga标记Fab的放化产率均在95%以上。经离心分离和加入EDTA柱纯化，两种⁶⁷Ga标记Fab的放化纯度均在99%以上。

⁶⁷Ga标记Fabs的稳定性估计。

在37°C小鼠血浆中培养⁶⁷Ga标记的Fab 24小时后，两种情况下90%以上的放射性保留在完整部分。

正常小鼠的生物分布研究。

总结了向正常小鼠注射⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab和⁶⁷Ga-NOTA-Fab后的放射性生物分布。血液中⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab的放射性水平与⁶⁷Ga-NOTA-Fab相似。尽管⁶⁷Ga-NOTA-Fab在注射后1至6小时内显示出肾脏高放射性水平，但⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab显示出显著较低的肾脏放射性水平。在同一时期。相比⁶⁷Ga-NOTA-Fab（20.81%ID），更多⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab在尿液中排泄（55.63%ID）。

尿液和肾脏中的放射性标记物。

图3显示了注射67-Ga-NOTA-IT-Fab后6小时获得的尿样的放射色谱图。SE-HPLC分析显示，95%的尿液中排出的放射性在低分子量组分中观察到，保留时间为24分钟。RP-HPLC分析表明，尿液中大多数放射性的保留时间与Ga-NOTA-Met相同（14.5分钟）。

提取每个肾脏匀浆的上清液，所有实验的效率都超过70%。在每种情况下，通过SE-HPLC分析注射⁶⁷Ga标记Fabs后1小时和6小时肾脏中的放射性标记物时，95%以上的放射性在低分子量组分中洗脱（数据未显示）。图4显示了通过10000截止膜过滤后肾脏样品的RP-HPLC色谱图。注射⁶⁷Ga-NOTA-MI-Fab后，低分子量组分中的大部分放射性在注射后1h与Ga-NOTA-Met相似的保留时间检测到。然而，该峰值在注射后6小时下降。另一方面，注射⁶⁷Ga-NOTA-Fab后，低分子量组分中的大部分放射性在注射后1小时和6小时的保留时间与Ga-NOTA-Lys相似。

方案1.制备NOTA-MI-Mala的合成程序

^a(a) SOCl2, MeOH; (b) Boc-Met, HOBt, DCC; (c) 4 N NaOH/EtOH; (d) Boc2O; (e) NMCM, NaHCO3; (f) 4 N HCl/ethyl acetate; (g) HOBt,

DCC; (h) 4 N HCl/ethyl acetate; (i) NOTA-Bz-SCN, triethylamine.

表1.注射67Ga-NOTA-MI-Fab和67Ga-NOTA-Fab<s

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