1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

一、研究背景

研究表明，与各类生物活性相关的调控蛋白的程序凋亡对于细胞的内平衡起着至关重要的作用。而泛素-蛋白酶体通路正是一种位于细胞内部且与蛋白凋亡相关的主要清除系统。癌症以及其他由调控蛋白缺失或特定信号级联系统永久激活所引起的疾病与调控蛋白的异常存在着重要的联系。因此，研究人员大胆猜测，通过调节泛素#8212;蛋白酶体通道，这类疾病可能会得到治疗。事实确实如此，蛋白酶体抑制剂#8212;硼替佐米（Bortezomib）已经被广泛的应用于多发性骨髓瘤以及复发细胞淋巴瘤病人的治疗，并且得到了很好的反响[1]。

但是硼替佐米对底物靶点的特异性并不够强，它会降解所有由泛素标记的蛋白质，而特性的缺失是药物发现过程中致命的缺陷，将会引起严重的副作用[7]。对硼替佐米的研究让人们意识到泛素蛋白酶体系（UPS）中靶点基质特异性的巨大潜力。一类泛素类似蛋白（UBLs）NEDD8（neural precursor cell-expressed development downregulated protein 8）与泛素在氨基酸序列上有着极大的相似性，可以通过与蛋白质Cullins共价结合而激活泛素#8212;蛋白酶体通路。由此，Millennium Pharmaceuticals研究人员开发出了NAE（E1 NEDD8-activating enzyme）抑制剂MLN4924，用来治疗恶性肿瘤。

二、由泛素化通路指导的底物降解

蛋白酶的降解通路开始于靶向分子与多聚泛素链相连接。第一步是将单独的泛素分子与E1（泛素激活酶Uba3）通过消耗ATP以硫酯键相连接。接下来E2（泛素连接酶Ubc12）从E1接受被激活的泛素，并在E3泛素连接酶的帮助下将其转移到靶向蛋白质的赖氨酸残基上。如图所示，通过E1-E2-E3级联酶促反应生成一串多聚泛素链，即”死亡信号”，之后被26S蛋白酶体的调节亚基所识别，将被标记的底物降解[1]。（Figure 1）

E3泛素连接酶促进底物蛋白泛素化，调节各类生物进程，包括细胞周期，信号转导以及变异。SCF复合体（Skp-1，Cullion ，F-box protein）以及CRLs（Cullin-Ring Ubiquitin Ligases）在E3连接酶家族中占据主要位置。其中，SCF连接酶底物特异性取决于其成分，尤其是F-box protein的组成模式。由SCF复合体标记的调节蛋白质见Table 1。因此，SCF复合体的调节异常将破坏许多生物进程，引起细胞周期阻断，细胞凋亡，甚至生成肿瘤[1]。

三、类泛素NEDD8路径

已知的类泛素蛋白质（UBLs）有9大类，共17种，其中研究较多的是NEDD8，SUMO（small ubiquitin-related modifier），ISG15，FAT10，Atg8 and Atg 12。而NEDD8与泛素在氨基酸序列上有60％的相似性和80％的同源性,并通过类泛素化过程产生作用（neddylation）。如图所示，NEDD8特异性蛋白酶能够水解NEDD8的C末端。被暴露的C末端甘氨酸被NAE（E1 NEDD8-activating enzyme）转化成腺甘酸（该过程消耗ATP）。之后，NEDD8通过硫酯键与E1半胱氨酸侧链结合。被激活的NEDD8接下来被转移到NEDD8连接酶，形成另一个硫酯键。E3 NEDD8连接酶将NEDD8转移到基质蛋白质的赖氨酸ε-氨基上形成一个异构肽键。NEDD8标记的蛋白质在CRL的组装和功能发挥上起着重要的作用。同时，通过对NEDD8去类泛素化酶COP9信号小体的研究发现，类泛素化作用是一个可逆过程，会发生去类泛素化过程（deneddylation）[1][4]。（Figure 2）

NEDD8作用的底物包括三大类：蛋白质Cullins，抑癌因子，原癌基因蛋白质。研究显示，NEDD8标记的蛋白质作为一个支架，通过协助泛素-E2复合体最为快速地定位到标记的底物，加强CRL泛素化的效率。其机制是Cullin的类泛素化作用能使其构象发生改变，加强Rbx1与E2的连接，减少E2与底物识别部分的距离。其他NEDD标记的底物包括致癌因子MDM2（the mouse double minute 2）、肿瘤抑制蛋白质（p53）、pVHL（the von Hipper-Lindau protein）、表皮生长因子（EGF）受体、与乳房癌相关的蛋白质3（BCA3）以及雌激素α受体（ERα）。由于目前所知的底物（除了Cullins）是从NEDD8过表达的细胞中发现的，所以现在还不能确定它们（包括p53、MDM2）是否在正常NEDD8条件下任然是NEDD8的底物。据观察，在肆意增殖的恶性肿瘤细胞中，NEDD8类泛素化水平相当的高。因此，该过程一直被认为是癌症治疗中一个相当有前景的靶点[9]。

四、MLN4929的作用机理及其构效关系

理论上讲，以UPS上游的蛋白酶为靶点可能会影响某些关键蛋白质的降解。所以，以某个具体的E3亚基为靶点将会选择性地调节唯一的蛋白质，从而

降低毒副作用、提高治疗指数。

MLN4929正是一类具有很高活性的小分子NAE选择性抑制剂，目前已开始进行固体癌和血液恶性肿瘤的临床试验。MLN4929是一类腺甘酸磺酰胺类衍生物，由先导化合物N-6-苯甲基腺苷通过高通量筛选获得。它能够选择性的抑制蛋白质Cullins的修改，从而导致CRLs底物水平的增加，而不会影响其他类泛素-E3连接酶的底物泛素化。MLN4929在结构上与AMP有着一定的联系，与NEDD8以共价键相连不可逆地形成复合物。NEDD8-MLN4929复合物的形成充分利用了E1反应的可逆性：研究显示，该复合物的合成首先要求ATP与NEDD8形成NEDD8-AMP复合物；随后NAE-NEDD8硫酯键形成，AMP得以释放；MLN4929的磺酰胺基团进攻位于NEDD8与NAE亚基Uba3之间的硫酯键，形成复合物，而该进攻靶点正是由AMP空缺出来的NAE核苷酸结合位点。该研究表明MLN4924是一类NAE的ATP竞争抑制剂，且一旦复合物紧密结合便会极其稳定，从而抑制NAE的酶活性[3]。

HCT-116结肠癌细胞的研究显示加入的MLN4924在复合物形成前5min就可以抑制NEDD8通路，同时减少以硫酯键相连的Ubc12-NEDD8复合物和类泛素化的Cullin蛋白。同时观察到，采用MLN4924培养HCT-116细胞能够引起细胞复制过程中S相的缺失，DNA损伤以及随之而产生的细胞凋亡。在异种移植试验中，低剂量的MLN4924能够通过加速细胞的衰老而抑制肿瘤细胞的生长。

最近的研究显示，MLN4924使CRL的底物水平得到了增加，从而在体外和异种移植样品中产生了对骨髓瘤白血病的抗癌效果。

Millennium Pharmaceuticals报道了另一种AMP类似物，compound 1。IC50为5nM时， compound 1能够与NAE、UAE、SAE牢固连接，并产生抑制作用。通过对compound 1与MLN4924的结构进行分析，合成了一系列6-（N-烷基）腺甘酸类似物compound 2，且烷基化取代基在大小、功能上有着很大的差别：

（1）当R基为直链脂肪族取代基时，C链长度小于等于6，对NAE的抑制作用随碳原子数的增加而逐渐加强；C链长度大于6时，抑制作用随碳原子数的增加逐渐减弱；支链将减弱其活性；

（2）当R基为环状脂肪族取代基时，其抑制作用较类似的直连烷基弱；但意外的是，随着环状脂肪族取代基尺寸的增加，其对NAE的抑制作用将显著增加；

（3）C6位氮附近有位阻效应时，对NAE的抑制作用将得到减弱；

（4）当R基连有呋喃或噻吩等杂环时，化合物有着一定的抑制作用且能提高代谢的稳定性，但比R基为正己基直链时作用要弱[9]。

五、其他NAE抑制剂

目前，已知的NEA抑制剂共有三种。除了MLN4924，其余两种均为天然产物，它们分别为：有着二肽共轭结构的鸭嘴花铜碱（deoxyvasicinone）衍生物（compound 3）和6,6#8217;#8217;-双黄酮（biapigenin, compound 4）。这两种产物均是通过对天然产物数据库进行虚拟筛选（Virtual Screening）所获得，其中化合物1的 IC50 为5μM，而化合物2 的IC50 为8μM，均为达到MLN4924的nM级，所以目前临床价值不大[2][10]。

六、展望

MLN4924与传统的抗肿瘤药截然不同：它对于肿瘤细胞有着良好的特异性，从而并不会完全阻断泛素#8212;蛋白酶体通路，使得其毒性大大降低。不过目前NAE抑制剂只有三种，其中也只有MLN4924正在进行临床试验，所以，沿着这条路线进行肿瘤治疗的研究具有着相当广泛的前景，同时也存在着诸多困难，这都有待于我们进一步的探索。

七、参考文献

[1]Tomoaki Tanaka,Tatsuya Nakatani,Tetsu Kamitani.Inhibition of NEDD8-conjugation pathway by novel molecules:Potential approaches to anticancer therapy.Molecular Oncology.2012,6:267-275.

[2]Hai-Jing Zhong,Victor Pui-Yan Ma,Zhen Cheng,Daniel Shiu-Hin Chan,Hong-Zhang He,Ka-Ho Leung,Dik-Lung Ma,Chung-Hang Leung.Discovery of a atural product inhibitor targeting protein neddylation by structure-based virtual screening.Biochimie .2102,9:2457-2460.

[3] James E. Brownell, Michael D. Sintchak, Substrate-Assisted Inhibition of Ubiquitin-like Protein-Activating Enzymes: The NEDD8 E1 Inhibitor MLN4924 Forms a NEDD8-AMP Mimetic In Situ. Mol. Cell. 37, 102#8211;111.

[4]Ian R.Watson,Meredith S.Irwin,and Michael Ohh.NEDD8 Pathways in cancer,Sine Quibus Non.Cancer Cell.2011,19:168-176.

[5] Michael A. Milhollen, Michael P Thomas. Treatment-Emergent Mutations in NAEb Confer Resistance to the NEDD8-Activating Enzyme Inhibitor MLN4924. Cancer Cell 21, 388#8211;401.

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

（1）研究或解决的问题

a.购买和合成候选化合物，进行生物活性检测，找出苗头化合物（μm级）；

b.研究苗头化合物与nae的预测结合模式，对苗头化合物进行结构改造，以获得结构新颖的先导化合物（nm级）；