文 献 综 述

1.ZPT概述

1.1 ZPT简介

ZPT（Zinc Pyrithione）的中文名为吡啶硫酮锌，别名为奥麦丁锌，外观呈白色固体，分子式为C₁₀H₈N₂O₂S₂Zn。ZPT具有很强的抗菌能力，能够有效地杀死产生头皮屑的真菌，具有很好的去屑功能，因而早就应用于洗发液。此外，它在涂料、杀菌剂等方面也有着广泛的应用^[1]，ZPT还被用于商业洗衣店以抑制织物上的霉菌生长^[2]。基于ZPT的洗发剂已被证明可有效治疗花斑癣，并且对头皮的银屑病非常有效^[2]。关于ZPT为什么能够去屑，学者们提出了几种解释，其中一种是它通过降低马拉色菌内的ATP（三磷酸腺苷或腺嘌呤核苷三磷酸）数量来破坏其正常代谢和增殖，减少头皮表面的马拉色菌，从而抑制头屑的产生^[1]-[3]。

1.2 ZPT的相关毒理学研究

在欧盟分类中，ZPT属于剧毒（T )。虽然ZPT能以不超过1.5%的含量加入洗发水（普通海飞丝中ZPT有效成分含量为1%）等日用化学品，但是大剂量接触或食用可能会有致命危险。有资料显示，gt;15mg/kg的ZPT涂敷于皮肤就能明显检测到对胚胎的致毒性，（折算为人用量为144mg/60kg人，而怀孕初期的妇女一般体重在50-55kg之间，则剂量更低），含有该类成分的产品都应该标示让孕妇慎用或只能低于某一个量否则可能会带来危险。正因ZPT与人类生活息息相关，对其进行毒理学评价显得尤为重要。目前，已有学者基于不同的动物模型对ZPT进行了毒理学研究。

日本茨城(Ibaraki)筑波(Tsukuba)Onogawa16-2号国家环境研究所区域环境处的采用二甲亚砜作为ZPT的溶剂研究ZPT对斑马鱼和日本青鳉的毒性，结果表明，含ZPT的洗发水对两类鱼的幼鱼有显著的致畸作用^[4]。

张旋等人采用静水生物测试法对麦穗鱼、青鳉、泥鳅鱼、直突摇蚊亚科二龄幼虫、河蚬进行了室内急性毒性试验。根据日本农药法对鱼毒性的分类标准，ZPT对上述生物有着和安特灵、硕丹等剧毒农药同等的毒性；根据我国有毒物质对鱼类的毒性标准，可以判断ZPT对麦穗鱼、青鳉、直突摇蚊亚科二龄幼虫属剧毒物质^[5]。

商群等人以中国南海常见的多毛类#8212;#8212;华美盘管虫(Hydroides elegans)作为受试生物,分别研究了吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌对早期不同发育阶段的华美盘管虫的急性毒理效应。实验结果表明,华美盘管虫精子对两种吡啶硫酮类防污剂的毒性的敏感性高于卵子。随着暴露时间的延长,幼虫对两种毒物的敏感性明显提高。实验结果还表明华美盘管虫担轮幼虫阶段对吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌毒性作用的敏感性显著(P＞0.05)高于后担轮幼虫阶段^[6]。

Dinning A J等人的研究表明吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌会破坏细菌细胞生物膜和膜两侧的pH梯度,也能与细胞内的金属离子和蛋白质结合,从而破坏细胞中ATP的合成,并造成一些金属离子的缺乏^[7]。

Yasokawa D等人采用DNA微阵列分析，表明吡啶硫酮锌可以使酿酒酵母产生铁缺乏。大多数明显上调的基因与铁转运有关，许多明显下调的基因与细胞色素（血红素）的生物合成有关。这些数据表明，ZPT导致严重的铁缺乏。为了证实DNA微阵列数据，在用铁补充了含有ZPT的培养物之后，酿酒酵母的生长显着恢复。研究表明吡啶硫酮锌的毒性主要来自铁缺乏^[3]。

Lamore S D等人首次证明培养的原代人类皮肤角质形成细胞和黑素细胞显示出对纳米摩尔浓度的ZnPT的高度易感性，显着诱导热休克反应的基因表达并导致基因组完整性受损。由于ZnPT通过哺乳动物皮肤渗透，本实验提高了这种局部抗菌剂可以在完整的人体皮肤中靶向并损害角质形成细胞和黑素细胞的可能性^[8]。

1.3 急救措施

① 眼睛接触:

如与眼部接触，用大量的清水进行冲洗，至少15分钟（冲洗时用手指保证上下眼睑分开）向医生进行求助。

② 皮肤接触:

如与皮肤接触，用大量的水进行冲洗，至少15分钟，脱去被污染的衣物和鞋，向医生进行求助。

③ 摄入:

如发生意外吞入，如患者清醒，立即协助患者用水清洗口腔，向医生求救。

④ 吸入:

如果吸入肺里,立即把人转移到空气新鲜的地方. 如有消化不良，向医生求助；如果没有呼吸，请用人工呼吸协助伤者；如果呼吸困难，请用吸氧机协助。

2.斑马鱼模型概述

2.1 斑马鱼模型简介

斑马鱼(Brachydanio rerio 或Danio rerio)是常见的暖水性(21～32℃)观赏鱼, 鲤科, 个体小(4～5cm), 常年产卵, 鱼卵易收集, 而且小规模饲养技术简单^[9]。斑马鱼体呈长菱形，尾部侧扁。雌鱼体较宽，腹部膨大，臀鳍淡黄色;雄鱼体较窄，体黄色，背部橄榄色，从背部至尾部和臀鳍，上有数条深蓝色条纹直达尾鳍，全身条纹似斑马纹，因而得名。尾鳍深叉形。各鳍黄色透明。由于条纹的多少和宽窄不同，以及鳍的差异，形成各个不同品种。斑马鱼对水温的变化有较强的抵抗力，只要水温不低于20℃即能生活，最适生长温度25℃。对各种动物性饵料或干饲料，都能食用。斑马鱼性情温和，喜结群游动，一般6月龄性成熟。雄性体型细长，颜色略深，条纹较为显著，为深蓝色条纹间柠檬色条纹；雌鱼身体肥胖，颜色稍淡，为蓝色条纹间银灰色条纹，在性成熟后腹部肥大。斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原肠胚期、分裂期、成形期和孵化期。斑马鱼胚胎发育过程如下^[10]：

斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。因为斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响。此外，雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。

斑马鱼由于养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明，已成为生命科学研究的新宠。全球范围内有超过1500个斑马鱼实验室。利用斑马鱼，可以研究生命科学的基础问题，揭示胚胎和组织器官发育的分子机理；可以构建人类的各种疾病和肿瘤模型，建立药物筛选和治疗的研究平台；可以建立毒理学和水产育种学模型，研究和解决环境科学和农业科学的重大问题。1982年，斑马鱼领域的创始人George Streinsger提出利用斑马鱼作为脊椎动物模型来研究环境致癌物引起的突变频率。在接下来的三十年中，斑马鱼已被用于识别致畸物，揭示常见毒物的作用机制，并了解毒物对脊椎动物影响的组织特异性^[11]。

2.2 基于斑马鱼模型的毒理学研究

斑马鱼胚胎发育技术具有材料方便易得、操作简单、可重复性及可靠性较高等优点, 而且与传统的鱼类急性实验相比, 具有成本低、影响因素少, 灵敏度更高等方面的优势^[9]。朱琳等人总结了斑马鱼胚胎毒性反应的指标，Strmac M等人选用 24 孔细胞培养板作为染毒试验容器, 倒置显微镜观察。胚胎发育直至孵化的 72h 内可以观察到近 20 种不同表现的反应指标^[12]。

段亚辉等人采用斑马鱼模型比较款冬叶、花的肝脏、肾脏毒性，为款冬叶的资源利用提供实验依据。以斑马鱼肝脏的荧光面积和肝脏丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平评价药物对肝脏的毒性，以斑马鱼表型变化结合培养液蛋白量评价药物的肾脏毒性。款冬花及款冬花配伍紫菀在高剂量时对肝脏产生一定的毒性，而款冬叶及款冬叶配伍紫菀未表现出明显的肝肾毒性，即款冬叶入药的安全性风险不高于款冬花。研究结果为款冬叶的资源利用奠定了基础^[13]。

Monaco A等人研究了氯化铝对斑马鱼幼鱼的毒性。将幼鱼暴露于氯化铝中72h，分析其表型和致死率。处理24小时、48小时和72小时后，对致死浓度分别为0.25、0.20和0.08 mM的幼鱼观察到较高的金属毒性。研究中观察了50%的幼鱼在100μM暴露48小时后的心包水肿和心率变化，同样浓度暴露的幼鱼在神经胶质细胞水平也有神经损伤，神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量显著减少。这项研究证实了这种金属的毒性，表明铝除了具有神经毒性外，还具有心脏毒性^[14]。

孔伟浩等人以斑马鱼胚胎为模型，研究了新式生物农药多杀菌素和乙基多杀菌素对鱼类等水生脊椎动物胚胎发育的影响。实验按照 OECD 标准进行。结果表明: 在斑马鱼的胚胎受精96 h 后，多杀菌素的 LC₅₀为 242.27 mg#183;L^－1; 乙基多杀菌素的 LC₅₀为 9.713 mg#183;L^－1。2种药剂对胚胎孵化后 24 h 1 min 内自主运动频率、48 h 20 s 内的心跳率、96 h 的体长均不存在剂量-效应关系; 药剂对胚胎 72 h 畸形表现为脊椎弯曲，2种药剂畸形率与浓度均存在剂量-效应关系。多杀菌素和乙基多杀菌素均属低毒，但在高浓度条件下，多杀菌素比乙基多杀菌素对鱼类更友好^[15]。

Fu J等人评估 了TDCPP 对脊椎动物发育的影响，使用斑马鱼胚胎/幼鱼作为动物模型来检查发育表型并通过使用微阵列和iTRAQ标记定量蛋白质组学来探索可能的毒性机制。结果表明，在受精后 0.75 小时用 TDCPP（3μM）处理，4hpf 时抑制细胞重排，导致 5.7 和8.5hpf 的外包延迟，并导致 14 至 45hpf 之间的异常发育（例如，尾巴变短，体型缩小）和致死率，这可能与调节胚胎发育的基因表达的改变有关。此外，观察到的躯干弯曲是暴露于 1 或 3μM TDCPP 的 96hpf 的斑马鱼幼鱼的主要表型，这可能是通过改变体节形成和与快速肌肉和软骨发育相关的蛋白质的表达^[16]。

杨瑞瑞等人研究了急性镉暴露对斑马鱼（Danio rerio）早期胚胎发育的毒性效应，分析了镉暴露后各个发育阶段胚胎死亡率和畸形率的变化，以及MDA含量和SOD活性的改变。结果显示，2 hpf的胚胎在不同浓度镉暴露下其死亡率未见明显变化（P＞0.05），而6，10，24 hpf 的胚胎在镉浓度高于8.90 μmol/L时其死亡率极显著增加（P＜0.01）；畸形表型统计分析显示，镉浓度高于 8.90μmol/L时，2，6，10，24 hpf胚胎畸形率均极显著性升高（P＜0.01）。进一步检测2，24 hpf胚胎的MDA含量和SOD活性，结果表明，镉暴露后早期胚胎MDA含量均随镉浓度升高逐渐增加，尤其在较高浓度组（17.80，35.60 μmol/L）显著高于对照组；而 SOD 活性随镉浓度升高发生显著变化。由此推断，急性镉暴露对早期斑马鱼胚胎发育具有较强的毒性作用，并造成了严重的氧化损伤^[17]。

周宇等人采用斑马鱼胚胎发育技术，对氯代苯类化合物的毒性进行测定，结果表明，该类化合物对斑马鱼胚胎发育均有明显抑制作用，可以造成胚胎发育畸形甚至死亡，具有特定的最敏感毒理学终点；随着苯环上取代氯数目的增加，其毒性也相应增强；其联合毒性对不同的毒理学终点大多呈拮抗作用^[18]。

Cao F等人研究了Cyhalofop-butyl对斑马鱼的急性和短期发育毒性，Cyhalofop-butyl是一种芳氧基苯氧基丙酸酯芽后除草剂，在世界范围内广泛用于农业。结果表明，Cyhalofop-butyl对胚胎的96-h LC50值、孵化后12 h、孵化后72 h、成鱼的LC50值分别为2.03、0.58、1.42、3.49 mg/L，表明斑马鱼早期对Cyhalofop-butyl的敏感性高于成鱼。在浓度为1.00 mg/L或更高时，Cyhalofop-butyl对斑马鱼存活幼鱼的自发运动、心跳、胚胎孵化率和体长均有抑制作用。Cyhalofop-butyl引起心包水肿、卵黄囊水肿、尾部变形、脊柱变形等形态学异常。结果表明，Cyhalofop-butyl对斑马鱼在不同生命阶段均有显著的负面影响，自发性运动和孵化率是评价Cyhalofop-butyl短期发育毒性的敏感终点^[19]。

3.检测项目与实验方法

在本课题中，将主要检测胚胎发育过程中内质网应激（ER-stress）、氧化应激（Oxidation）、自噬（Autophagy）及细胞凋亡（apoptosis）的改变。

内质网（ER）在维持细胞功能中起关键作用^[20]。破坏ER稳态的刺激将影响相关蛋白质折叠并进一步诱导ER应激和功能障碍，这将导致许多疾病^[21]-[24] 。内质网应激（ER stress）表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱 ,可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和 caspase-12 介导的凋亡通路等信号途径 ,既能诱导糖调节蛋白 (glucose2regulated protein 78 kD , GRP78) 、GRP94 等内质网分子伴侣表达而产生保护效应，亦能独立地诱导细胞凋亡。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如适应、损伤或凋亡。生物体已经进化出未折叠蛋白反应（UPR）以恢复ER稳态^[25]，但如果ER应激太严重而无法消退，则ER应激将诱导细胞凋亡。例如，2,4,6-三硝基甲苯通过ER应激和线粒体功能障碍诱导细胞凋亡^[26]。此外，ER应激可引发氧化应激和自噬^[27]-[28]。

自噬对维持细胞存活至关重要^[29]-[31]。自噬参与细胞成分（例如线粒体和ER）的再循环，以维持细胞稳态^[32],[33]。一些研究已经证明，自噬发生在与细胞凋亡相同的细胞中并且通常在细胞凋亡之前^[34]。大多数研究的重点是自噬诱导严重的细胞凋亡和坏死，而关于自噬在生物过程中的重要作用的研究是有限的^[20]。

已知氧化损伤可诱导细胞损伤^[35]。活性氧（ROS）可导致细胞死亡^[36]-[38]。最近的研究表明，ROS参与了环境化学物质诱导的细胞毒性。例如，苯醚甲环唑暴露可能对斑马鱼造成氧化损伤，并进一步导致肝脏毒性^[39]。

本课题用到的主要实验方法有PCR、western blot及原位杂交。

PCR ,即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reac-tion , PCR)是1985年由美国 PE -Cetus 公司的科学家K.B.Mulis 发明的一项可在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的新技术^[40]。PCR可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外摄氏95#176;高温时变性会变成单链，低温（经常是60#176;C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72#176;C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

qRT-PCR 技术是一种基于普通 PCR 技术结合荧光化学物质发展而来的核酸定量方法。该技术具备识别特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单、自动化水平高等优点，已成为研究基因表达定量分析的首选方法，广泛应用于生物体内基因功能的研究^[41]。实时荧光定量#8194;PCR#8194;反应中，引入了一种荧光化学物质，随着#8194;PCR#8194;反应的进行，PCR#8194;反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。实验步骤:反转录（依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA）、扩增（用PCR的方法扩增cDNA）、检测（实时检测和定量扩增的产物）。

Western Blot（蛋白质印迹法）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。样品在缓冲液中匀浆，并在13000转/分的转速下离心20分钟。将大约20毫克的蛋白质变性、电泳并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）上。用3％BSA-TBST封闭膜，用LC3（MBL，M152-3，1:500）孵育，随后用5％脱脂乳TBST和抗兔免疫球蛋白G二级抗体（TDY，S004，1:10000）封闭，遵循制造商的说明。使用Image Lab#8482;软件（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）进行光密度分析^[20]。

原位杂交（in situ hybridization）是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目标mRNA或DNA 的存在并定位；用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。

荧光原位杂交技术是根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记 DNA 或者 ＲNA 探针与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况^[42]。

Yang Yang等人研究了thifluzamide诱导斑马鱼肝毒性中的ER应激下的潜在机制。研究显示thifluzamide显著改变了编码抗氧化蛋白的基因的表达，并增加了丙二醛（MDA）含量，导致斑马鱼肝脏的氧化损伤。此外，通过透射电子显微镜（TEM）观察自噬超微结构，并且在蛋白质印迹（WB）测量下看到LC3-I/LC3-II转换明显上调，证实thifluzamide诱导自噬。此外，Caspase-3和Caspase-9的活性明显降低，表明暴露于更高浓度的thifluzamide的成年斑马鱼的细胞凋亡受到抑制。总之，ER损伤下的氧化损伤和自噬而非细胞凋亡可能导致thifluzamide在斑马鱼中的肝毒性。ER应激和氧化应激未能维持细胞稳态。自噬（红色）明显上调，但细胞凋亡（蓝色）明显受到抑制^[20]。

4.总结

综上，由于ZPT在日常生活中的广泛使用，对其进行毒理学评价显得非常重要且具有社会意义。目前，国内外已经有学者基于不同的动物模型对ZPT进行了毒理学评价，但尚未形成完整的体系。斑马鱼模型作为优秀的模型生物，非常适宜作为ZPT毒理学评价的动物模型。目前，国内外基于斑马鱼模型的毒理学评价中，对0 hpf-24 hpf的毒理学评价很少，基于斑马鱼模型的ZPT毒理学评价的相关文献也屈指可数。我前期参与的课题研究表明ZPT对斑马鱼的整体发育具有显著的毒性，但是尚未进行ZPT对0 hpf-24 hpf胚胎分化阶段的毒理学评价。因此，本课题将通过相关实验弥补这方面的空白，补充完善基于斑马鱼模型的ZPT毒理学评价的相关研究并通过PCR、western blot及原位杂交等实验方法检测胚胎发育过程中ER-stress、Oxidation、Autophagy及apoptosis的改变，从而鉴定ZPT对胚胎细胞分化方面的毒性，研究产生毒性的机制。

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