1. 研究目的与意义（文献综述）

1.目的及意义（含国内外的研究现状分析）

文献综述：

1.1银杏简介

银杏是银杏科、银杏属落叶乔木。银杏树的果实俗称白果，因此银杏又名白果树。银杏树生长较慢，寿命极长，自然条件下从栽种到结银杏果要二十多年，四十年后才能大量结果，因此又有人把它称作“公孙树”，有“公种而孙得食”的含义，是树中的老寿星，具有观赏、经济、药用价值。据《本草纲目》记载，其性平、味甘苦，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂之功效；现代研究表明，银杏叶中含有黄酮类、内酯类、多糖类、酚类等多种活性物质，具有保护神经系统、改变血液流变学、免疫调节、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂等生物活性。

1.2银杏的研究价值

银杏叶中含有的黄酮类化合物种类超过40种，具有极强的清除自由基和抗氧化能力，故而广泛用于预防和治疗心脑血管疾病。银杏叶提取物在治疗和预防疾病方面具有显著的功效，其应用之广涉及医药、生物农药、兽药、食品、化妆品等。

目前银杏叶与银杏果都是非常优质的资源，除了满足国内销售之外，还大量的出口海外，如泰兴白果年产量约占全国总产量的1/3，品质极高。银杏叶产业近年来迅猛发展，但相应的市场秩序与质量监管确还远远不够。由于银杏叶提取物产业是在近年来快速发展，占重要出口量的很大一部分，而国外厂商由于具有技术优势，不断提高质量标准并加高门槛。从2004 年起，国际市场加大了对对银杏叶提取物的需求，与此同时伴随着国内市场药品金额迅速增长的形势，导致银杏叶提取物价格增长了1倍。对银杏叶、果、外种皮的提取条件进行优化能提高提取效率并准确的测定其中活性成分的含量，使提取做到有的放矢、银杏资源利用率最大化。

我校李玲等选用乙醇、丙酮、60%乙醇和60%丙酮4种萃取剂，以银杏叶为参照物，对同一银杏树的果、叶和外种皮中的黄酮苷、萜内酯、银杏酸、多糖以及多种微量元素进行了提取和比较分析。

图1 四种萃取剂下黄酮苷、萜内酯、银杏酸、多糖含量对比

表1列出了原子吸收测得的白果种仁、叶、外种皮中K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn无机元素含量。结果表明，银杏叶中无机元素含量最高，其次为白果种仁，外种皮元素含量最低。另外，4种萃取剂中含水萃取剂对无机元素的萃取能力高于非水体系。

探究所得结论：银杏叶中黄酮苷和萜内酯含量最高（14.0 mg.g^-1）（1.40 mg.g^-1），其次是外种皮（0.67 mg.g^-1和0.19 mg.g^-1），白果种仁中黄酮苷和萜内酯含量最低（0.17 mg.g^-1和0.073 mg.g^-1）。多糖含量大小顺序为外种皮（835 mg.g^-1）、白果种仁（76.8 mg.g^-1）、叶（26.3 mg.g^-1）；银杏酸含量依次为，外种皮（128.8mg.g^-1）、银杏叶（26.5 mg.g^-1），白果种仁（2.1 mg.g^-1）。另外，3者均含有丰富的K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn元素。4种萃取剂测得生物活性物质含量相差很大，其中60%乙醇对黄酮苷、萜内酯和多糖的萃取测量值最高，乙醇对银杏酸的萃取效果最好。

1.3银杏生物活性物质的提取方法

1.3.1黄酮类化合物提取

根据文献报道，银杏叶总黄酮提取方法主要有水浸法、酮类提取—氨水沉淀法、乙醇溶剂提取法、负压沸腾提取工艺、微波提取工艺、超声提取工艺等。

1）水浸法

闫高颖等^[1]用水作为提取溶剂，对银杏叶总黄酮成分的提取工艺参数进行了考察，并采用正交设计优化，得出提取银杏叶总黄酮的最佳条件为：用 26 倍量的水在 100 ℃条件下提取 3 次，每次 1 h，该条件下银杏叶总黄酮的提取率达 0.59%，这种方法可降低生产成本。

2） 酮类提取—氨水沉淀法

李雨蔚等^[2]采用酮类提取—氨水沉淀法，对金叶银杏落叶中总黄酮成分的提取进行了研究，并应用响应面分析法对其总黄酮的提取条件进行了优化，得出最佳工艺条件为：液固比 13.5 mL/g、丙酮与水的比例为70∶30、提取温度 55 ℃、提取时间 3 h。鉴于目前我国对于以丙酮—水为提取溶剂的研究报道较少，此工艺能为银杏叶总黄酮的提取提供新的思路。

其大致方案：准确称取银杏叶粗粉约10 g，用一定体积、一定比例的丙酮－水溶液，在一定温度下加热回流提取一定时间，过滤、碱化滤液后再过滤沉淀，滤液加硫酸调pH，用一定量的丙酮混合液萃取，加入硫酸铵，过滤后将滤液浓缩，用体积分数70% 的乙醇定容到50 mL 容量瓶，再用移液管从中取出0. 5 mL 溶液到25 mL 容量瓶中，按标准曲线测绘的方法显色，定容，根据所作标准曲线测定总黄酮含量．

总黄酮含量(%) = ( 提取所得总黄酮的质量÷银杏叶粗粉的质量) × 100

该法先以亚硝酸钠-硝酸铝显色法绘制标准含量曲线，结果在浓度0. 012 ～ 0. 060 g/L内表现出良好的线性关系，并得回归方程y =11. 862x 0. 0068，Ｒ₂ =0. 9993

以纵坐标吸光度为标准，通过单因素实验确定了最佳液固比、溶剂浓度、提取时间、提取温度，最后通过响应面法判断两因素之间的交互关系，优化实验条件

3）乙醇溶剂提取法

鲍宇茹等^[3]采用乙醇溶剂提取法，对采集于河南工业大学校园的银杏叶中黄酮类物质进行提取，并通过正交试验得出最佳的提取工艺参数为：提取温度 80 ℃、乙醇体积分数 70%、提取时间 120 min、液固比 5∶1，该条件下银杏叶总黄酮提取率为 89.8%。

4）负压沸腾提取工艺

负压沸腾提取工艺的原理是溶剂的沸点会随外界大气压的降低而降低，所以在负压条件下，可在较低的温度下使溶液处于沸腾状态，然后进行提取。周昊等^[4] 为减少银杏叶中总黄酮等有效成分的热分解，采用负压沸腾提取工艺，提取采自邳州银杏叶生产基地的银杏叶（银杏黄酮质量分数为 9.80%） 中的总黄酮等热敏性成分，并通过响应面分析法优化后得出最佳的提取工艺参数为：乙醇体积分数 60%、提取压力 -0.08 MPa、提取时间 70 min、提取温度 50 ℃、液固比 10 mL/g、提取 2 次，该条件下银杏叶总黄酮提取率为 93.55%。

5）微波提取工艺

微波提取工艺的原理是细胞吸收微波能后内部温度迅速上升导致细胞破裂，使细胞内有效成分自由流出，随后在较低的温度条件下被萃取、过滤和分离。王卫华等^[5]为优化银杏叶总黄酮的提取及纯化的最佳方法，以采自山东菏泽郊区的银杏叶为原料，通过微波提取工艺，以银杏叶中总黄酮提取液在 510 nm 所测吸光度为参考指标，确定以银杏叶为原料微波提取总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数 80%、料液比 1∶40、提取 1 次、提取时间 1 h，该条件下银杏叶总黄酮提取率为 91.4%。

6） 超声提取工艺

基本原理：超声波的能量传递给溶剂气泡，使之产生振动共振腔产生，并在瞬间闭合，此时会形成几千个大气压，巨大的气压使植物细胞壁破裂，释放出活性成分

申伟培^[6]等以银杏叶中总黄酮醇苷和银杏内酯类成分含量的综合评分为指标，以超声提取工艺辅以正交设计优化，得出最佳提取工艺为：用 70%乙醇超声提取 1次，每次 20min，超声提取功率为 150 W。崔润丽等^[10] 通过正交试验与超声提取工艺研究银杏叶中总黄酮类化合物的最佳提取条件，结果表明，超声波辅助提取法仅用 10 min，其提取效率比乙醇浸提 5 h 的提取率高出 9%，比微波辅助提取工艺高出 6.1%。

周艳红等^[7]通过响应面法优化超声辅助离子液体提取银杏叶总黄酮，最佳工艺条件为：料液比1：40（g/ml）、提取时间22min、离子液体浓度1.1mol/l、提取温度54℃，在此条件下，银杏叶总黄酮提取率为26.48g/ml，回归模型拟合度较高，实际应用价值高。该方法操作简单、提取率高、提取时间短，是一种理想的中药提取新方法，可作为不同类型中药有效成分提取方法的选择。

固定任意１个因素在编码值０的水平，研究剩余２个因素对银杏叶总黄酮提取率的影响，结果如图２所示。

图２ 因素交互作用对银杏叶总黄酮提取率的影响

通过响应面法直观的表现出任意两种影响因素之间的交互作用是否显著

表2-1各类提取方法对比

	固液比	温度/℃	提取方式	提取率/%	辅助条件
水浸法	1/26	100	1h*3次	0.59
酮类提取	1/13.5	55	3h/次
乙醇提取	1/5	80	70%乙醇*2h	89.8
负压沸腾提取	1/10	50	70min*2次	93.55	压力-0.08 MPa
微波提取	1/40		1h*1次	91.4	微波
超声提取	1/40	54	20min*1次	97.5	超声功率150w

表2-2 各种提取方法优缺点比较

1.4银杏内酯

银杏内酯和银杏黄酮是银杏叶及其提取物中的重要活性成分。目前，国际上标准的银杏叶提取物是按照德国Schwabe 专利工艺生产的EGb761，含有24% 的黄酮苷和6%的萜内酯( 2.8% ～ 3.4%的银杏内酯A，B，C 及2.6% ～ 3.2%的白果内酯) ，该标准已成为世界许多国家进出口银杏叶制剂的质量标准。

近年的研究发现，银杏内酯类成分亦是甘氨酸受体( GlyR) 强有力的拮抗剂，具有明显的中枢神经系统保护作用。

银杏内酯类成分主要包括二萜和倍半萜类结构，它们是目前为止发现的唯一拥有叔丁基官能团［-C₁₇( CH₃)₃］的天然物质。早在20世纪30年代，已有学者开展了银杏叶中活性成分的提取分离。1932 年，Furukawa 等^［8］首次从杏叶中分离得到银杏内酯A，B，C。1967，Nakanishi^［9］和Sakabe^［10］等采用化学和光谱等方法对其结构进行鉴定，并从银杏的根皮中分离得到银杏内酯M，1971 年又从银杏叶中分离得到倍半萜类成分白果内酯。随着科学技术的发展，1972 年Weinges 等利用核磁和质谱技术对白果内酯和银杏内酯A，B，C 的结构进行鉴定，1987 年又从银杏叶中分离得到银杏内酯J^［11］。2001 年，王颖等从银杏内酯提取物中分离得到银杏内酯K 和银杏内酯L。2009 年，Zhang 等从银杏叶中分离出银杏内酯N。2011 年，Liao 等从银杏叶中分得2 个微量成分银杏内酯P和银杏内酯Q。在上述各成分中，银杏内酯B，M，J，P 互为同分异构体; 银杏内酯Q与银杏内酯C互为同分异构体。各成分的结构见图3。

图3 银杏内酯类成分的化学结构

2. 研究的基本内容与方案

1 本课题的研究（设计）的目标：

1）分别从银杏叶、白果、银杏外种皮中提取生物活性物质（黄酮类化合物、萜内酯和银杏酸等）

2）分析提取结果，得出不同条件下的提取情况。

3）筛选最快速得到大量黄酮类化合物、萜内酯和银杏酸等提取物的高效综合性提取方案

2 本课题的研究（设计）的基本内容：

采用工艺简单，成本较低的回流提取法

提取溶剂的选择

溶剂提取法需针对不同的提取目标物而选择极性的不同溶剂，乙醇、甲醇、丙酮、石油醚，其中乙醇、甲醇与丙酮能将银杏中各类活性成分均提取出来，甲醇由于毒性较强，不适合用于此类成分的提取，直接以弱极性石油醚作为提取溶剂提取出的成分主要是银杏酸，不能将银杏外种皮中的活性成分全部提取出来，乙醇是比较好的选择

提取方案：称取粉末2.00 g，置于100ml圆底烧瓶，接回流冷凝管，加入提取剂20 mL，恒温下回流提取1.0 h，取上清液离心得提取液，添加提取剂重复提取两次，取少量提取液检测提取物含量

实验探究：单因素实验

1. 温度对提取效率的影响

设置温度梯度45、60、75、90摄氏度，提取剂60%乙醇溶液

1. 提取溶剂对提取效率的影响

溶剂选用双蒸水、乙醇浓度分别为30%、50%、70%、90%、无水乙醇、，提取温度75℃

1. 提取时间对提取效率的影响

溶剂60%乙醇，提取温度75℃，提取时间15min、30min、60min、90min单次提取

分别绘制趋势图，探究不同因素对提取效率的影响趋势，确定增长趋势最快的变量区间从而确定最快速提取的温度、溶剂浓度和提取时长

进一步确定最优工艺条件的组合与确定提取温度（A）、提取时间（B）、溶剂浓度（C）提取次数（D）这四个因素的分别对于银杏酸黄酮类化合物、萜内酯和银杏酸提取量影响的大小和最优水平，根据整齐可比性和均匀分散性原则来选择合适的水平。本实验选取3个实验水平，得到如表所示的正交试验因素水平表

正交实验因素水平表

因素	水平
1	2	3
提取温度/℃	10	30	50
提取时间/min	10	20	30
提取剂浓度/%	20	45	70
提取次数/次	1	2	3

3. 研究计划与安排

3．进度安排

第1——3周：查阅相关文献资料，明确研究内容，了解研究所需药品、仪器。确定方案，完成开题报告。

第4 ——8周：完成温度、溶剂的提取单因素实验

4. 参考文献（12篇以上）

[1] 闫高颖，张必荣，张敏，等.水浸法提取银杏叶总黄酮工艺的研究[j]. 西北药学杂志，2016，31(06)：560-562.

[2] 李雨蔚，王晓玲.响应面法优化金叶银杏落叶总黄酮提取工艺[j]. 西南民族大学学报：自然科学版，2015，41(06)：701-707.

[3] 鲍宇茹，张慧茹，刘来亭. 银杏叶黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究[j]. 河南工业大学学报：自然科学版，2016，37(05)：96-99.