摘 要

4-羟基壬烯醛（HNE）是一种重要的脂质体过氧化产物，具有显著的生物毒性，因此如何对其进行高灵敏度高选择性检测是极为重要的。但由于生物样品中HNE的相对丰度较低且HNE本身极性大、稳定性差，直接对其进行检测较为困难。

本论文拟采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术结合稳定同位素标记对HNE进行定性、定量分析。我们选择使用¹²C和¹³C标记的氨氧类香豆素荧光试剂4-(4-(a minooxy)butyl)-7-(1-((2S，3R，4S，5S，6R)-3，4，5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)-2H-chromen-2-one以下简称(AHPC)对HNE进行衍生化反应；结合高分辨质谱法对HNE进行半定量分析；最终，将之应用到疾病与健康人群血清样品中的HNE分析，以期发现与HNE密切相关的疾病。具体工作如下：

1. 我们对¹²C和¹³C标记的进行了质谱表征。
2. 为了验证实验衍生产物与目标衍生产物吻合，我们对¹²C标记的AHPC试剂进行了一级质谱和二级质谱分析。
3. 为了使色谱峰强度最高，我们对影响衍生化反应的4个主要条件进行了优化。
4. 我们对该衍生化反应的可行性进行验证。
5. 我们对轻重同位素试剂内标方法时候可行进行验证。

通过上述实验证明，AHPC衍生试剂可以成功标记HNE，说明了实验的可行的。使我们下阶段，疾病标志物中醛类半定量分析的工作可以正常展开。

关键词：小分子荧光探针；同位素荧光标记；LC-MS/MS；，4-羟基壬烯醛（HNE）

Abstract

4-hydroxynonenal (HNE) is an important liposome peroxidation product with significant biological toxicity, so how to perform high sensitivity and high selectivity detection is extremely important. However, because the relative abundance of HNE in biological samples is low and HNE itself has large polarity and poor stability, it is difficult to directly detect it.

In this thesis, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was combined with stable isotope labeling for qualitative and quantitative analysis of HNE. We chose to use 12C and 13C labeled ammonia coumarin fluorescent reagent 4-(4-(a minooxy)butyl)-7-(1-((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4, 5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)-2H-chromen-2-one (AHPC) for HNE Derivatization and optimization of its derivatization conditions; semi-quantitative analysis of HNE in combination with high-resolution mass spectrometry; finally, it is applied to HNE analysis in serum samples from disease and healthy people, in order to find diseases closely related to HNE. The specific work is as follows:

(1) We performed mass spectrometric characterization of the ¹²C and ¹³C markers.

(2) In order to verify that the experimental derivative products are consistent with the target derivative products, we performed primary mass spectrometry and secondary mass spectrometry analysis on the 12C-labeled AHPC reagent.

(3) In order to maximize the peak intensity, we optimized the four main conditions affecting the derivatization reaction.

(4) We verify the feasibility of the derivatization reaction.

(5) We can verify the feasibility of the internal standard method for light and heavy isotope reagents.

It was proved by the above experiments that the AHP-derived reagent can successfully label HNE, indicating the feasibility of the experiment. In the next stage, the semi-quantitative analysis of aldehydes in disease markers can be carried out normally.

Key Words: Fluorescent probe; isotope fluorescence labeling; LC-MS/MS; 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)

目录

第 1 章 绪论 6

1.1小分子醛类的概述 6

1.1.1醛类化合物的来源 6

1.1.2醛类化合物的检测意义 7

1.1.3醛类化合物的检测流程 8

1.2常用醛类化合物衍生方法及其特点 9

1.2.1衍生化反应简介 9

1.2.2醛类衍生化方法 9

1.3醛类化合物检测技术与前处理技术 10

1.3.1样品前处理技术 11

1.3.2紫外-可见分光光度法 11

1.3.3气相色谱法 11

1.3.4高效液相色谱法 12

1.3.5液相色谱-质谱联用 12

1.4稳定同位素标记-液相色谱-质谱联用法分析醛类化合物的研究进展 14

1.5本论文的选题依据与思路 15

第2章 长脂肪链¹²C和¹³C标记的羟基糖修饰的氨氧类香豆素小分子荧光探针与4-羟基壬烯醛的衍生反应 16

2.1 引言 16

2.2实验部分 17

2.2.1实验试剂 17

2.2.2实验材料与仪器 17

2.2.3 标准品溶液的配制 18

2.2.4 衍生过程 18

2.2.5色谱-质谱（nLC-MS）条件 18

2.3 结果与讨论 19

2.3.1 AHPC质谱的测定 19

2.3.2衍生化反应初探 19

2.3.3优化衍生条件 23

2.3.4 实验方法验证 24

2.3.5 轻重同位素试剂内标方法验证 25

2.4结果与讨论 27

第3章 总结与展望 28

致谢 32

第 1 章 绪论

1.1小分子醛类的概述

1.1.1醛类化合物的来源

醛类化合物是指一类含有羰基且在羰基碳原子上取代有至少一个氢原子的化合物。醛类化合物可通过结合到羰基碳的取代基的不同可分为以下四种类型：

（1）脂族醛和取代基，其羰基碳连接是一个脂肪族取代基，如乙醛。丙醛等;

（2）芳族醛，这意味着结合的羰基碳的取代基，所述抗体是芳族取代基，如苯甲醛，香草醛，等等。

（3）a，β不饱和醛，即羰基的a和β位之间丙烯醛等不饱和基团。

（4）α-氧代醛，即羰基的α-位被乙二醛，乙醇醛等氧原子取代。根据分子中醛基的数量，醛化合物可分为单醛，二醛和多价醛。取决于与羰基碳连接的取代基的饱和度，醛化合物也可分为饱和醛和不饱和醛。

醛及其衍生物广泛分布在环境和生物体中，并且来源大致细分为人类社会中的自然活动，生产和排放。例如，醛可以在自然过程中自然产生，例如生物的释放，大气中的光化学反应和火山爆发。 大气中产生的挥发性醛类也可以通过潮湿沉淀进入水中。 大量研究表明，在许多不同的生物基质中检测到多种醛类（包括血液^[1]，尿液^[2]和呼出气^[3]），这些醛类化合物与许多疾病密切相关。

1.1.2醛类化合物的检测意义

“有毒化学品优先控制” 名单上不少醛类物质在排到前列，被世界卫生组织定性为使人致癌和致畸物质，大量研究表明有刺激性、生物毒性是醛类化合物的特性。醛类化合物是公认的潜在突变物之一，也是重要变态反应源。某些醛类例如：国际癌症研究机构(ARO)认定甲醛具有致基因突变和致癌性。醛类污染物监测的重要性也被人们也越来越重视。重要的环境污染物之一就是醛类^[12]，具有挥发性强、分子量较小、可溶于水是醛类化合物的性质，扩散到大气和水体中就非常容易，也容易被人体吸收，就会不同程度的影响人体健康产生。例如，大气中的甲醛可以引发皮肤炎、哮喘、肺水肿以及致癌;丙烯醛会引起眼、鼻和咽喉的不适，并且与动脉硬化和阿尔兹海默氏病等疾病有关。某些醛类化合物如：壬醛和癸醛，因具有花果香味在食品和饮料工业中可以起到增香调味作用，因此常作为调味剂加到食品中。此外，丙烯醛还会蛋白质抑制肿瘤的能力下降，引发肺癌:4-羟基壬烯醛则会与DNA的四个碱基发生反应形成加合物，抑制DNA的合成与重组。而且它还可以与蛋白质反应从而改变生物分子，破坏重要的细胞功能，诱发突变。

对于小分子量醛的分析，知它们与许多疾病的病理和进展有关，包括糖尿病，动脉粥样硬化和心脏病，而且引起人们高度关注.某些醛类化合物在食品和饮料工业中可以起到增香调味作用，如壬醛和癸醛具有花果香味^[13]，因此常作为调味剂加到食品中。但是，当醛在食品中的含量超过阈值时将会加速食物腐败，从而影响食品的颜色、质地和风味，危害人体健康。例如，酒中的乙醛能与核苷酸的氨基反应生成混合缩醛，增大女性患乳腺癌的风险;此外，糖类物质在一些食品中经过热加工处理等过程会产生糠醛类化合物，而糠醛类化合物会对人体皮肤、粘膜和眼睛产生刺激性作用，并且能与人体中蛋白质结，过量食用甚至会引起中毒。一种重要的脂质体过氧化终产物是生物体内源性醛类，它们与衰老、疾病等过程息息相关。我们探究相关的生理与病理过程中，监控生物样品中的醛类化合物可以有效促进我们的研究。研究发现，某些醛类化合物可作为多种疾病，如糖尿病、心血管疾病、肺癌等的生物标志物^[14]。Ulanowska等人^[15]在对137例确诊肺癌患者的呼出气样本进行分析检测时发现，与健康的非吸烟者相比，仅能在肺癌患者的呼出气中检测到了戊醛、己醛和壬烷。研究成果将会提供一个从健康的人群中鉴别出肺癌患者的可行方案。

1.1.3醛类化合物的检测流程

在环境污染物分析，食品安全和医疗卫生方面，对低分子量醛类检测都是尤为重要的，已成为当前研究的重点之一。该邻域中，对低分子量醛的分析，为了使检测方法具有高灵敏度和高选择性的种种开发仍旧是一个挑战，因为：（1）亲水性是低分子量醛的特点，并且比较常见。所以需要一系列预处理，例如浓缩富集，提取等，以从复杂基质中提取。（2）在一些高度敏感的仪器，光学仪器和质谱，有好的响应通常需要适当预处理的方法，例如衍生化法或提取法，（3）低分子量醛，有一些固有的性质比如波动性和不稳定性等。目前，醛类分析的主要步骤，如图1-1。

图1-1醛类化合物的检测流程图，

GCMS:气相色谱-质谱联用法;

HPLC-UV/MS/FLD:高效液相色谱-紫外检测/质谱检测/荧光检测

1.2常用醛类化合物衍生方法及其特点

醛类化合物的亲水性会产生一下不好的影响：影响在反相色谱柱上的保留时间；质谱响应较差。醛类无生色团或荧光团也会影响它们的光学检测。气相色谱分析中小分子醛类的热不稳定性会影响了它们的检测。为了解决这些问题，面对不同的检测方法需要采取与之相应的衍生化策略。

1.2.1衍生化反应简介

化学衍生法是指将特定的基团通过化学反应与待测物质相连，从而使原本不能进行检测或检测效果不好的物质可以进行检测的方法。此方法要求衍生反应迅速、反应选择性高、衍生产物尽量单一、可以定量进行以及通用性好。根据衍生反应是否与仪器联机，可将衍生反应分为在线和离线两种。根据衍生反应发生地点的不同，可分为三类^[16]，分别为柱前衍生法、柱中衍生法和柱后衍生法。目前，常用样品衍生方法中应用最广泛的一种衍生技术是柱前衍生法，与柱后衍生法相比，柱前衍生法具有很大的自由性。该方法主要有以下几种优点:

(1) 衍生化反应的分离效果，往往不受动力学影响;

(2) 衍生化反应的实验条件可以有各种优化手段优化;

(3) 衍生化反应所用的溶剂和流动相不需要特殊配对;

(4) 可以通过预处理来降低或消除衍生化的副产物所带来的干扰

1.2.2醛类衍生化方法

1.2.2.1肼衍生法

肼衍生法：是衍生试剂中的肼基(NHNH2)的与醛类中的羰基发生缩合反应^[17]，生成衍生化产物为腙类衍生产物。

虽然肼衍生化法衍生效率高，目前最为常用，但由于以Z-和E-两种异构体形式存在肼衍生化产物通常，会对色谱分析产生影响，是分析变得苦难，测量结果容易有较大误差。另外，肼衍生化反应条件较为剧烈，样品基质中的副反应可能会被引起，导致分析结果发生错误。Marcia等人^[18]36曾报道，在肼衍生化过程中鱼肉中三甲胺氧化物会分解产生的甲醛和三甲胺从而导致甲醛含量的升高。此外，肼有不稳定性，易燃性和刺激性等特性，甚至可作为火箭燃料。

1.2.2.2肟化反应

肟化反应是O取代羟胺化合物与羰基类化合物发生缩合反应，失去一分子水生成肟式产物的一种反应。O-2，3，4，5，6-五氟苄基羟胺( PFBHA) 是较为长见的O-取代羟胺衍生试剂。

羰基类化合物与O-2，3，4，5，6-五氟苄基羟胺^[17]的衍生反应。该反应生成的衍生产物具有良好的热稳定性，因此气相色谱-质谱法(GCMS)检测常用来检测它。

目前挥发性醛类分析最主要方法之一是O-2，3，4，5，6-五氟苄基衍生化法结合(GC)检测，但由于醛类的极性和亲水性，该方法通常都需要采用萃取技术将挥发性醛类与基质分离，这样分析步骤变多、分析时间变长，引入分析误差可能会在萃取过程中发生。研究发现，目前对于检测结果甲醛和乙醛等小分子醛类来说，会有一定的背景干扰^[18]。最后，肟式衍生产物由于存在C=N键，会产生顺反异构，产生异构化现象，在色谱上表现为两个色谱峰，也会对分析带来干扰

1.2.2.3还原氨化反应

还原氨化反应是利用含氨基的衍生试剂与醛类物质的醛基反应生成席夫碱，再通过还原得到稳定的CN单键的衍生产物。新的同位素编码的衍生试剂可以在酸性条件和 NaNBH₃存在下很容易地标记醛类化合物。

还原氨化法主要应用于糖类和某些醛类的标记^[19]，但该衍生方法对反应条件要求较为苛刻，所需反应时间长、反应温度较高。并且由于需要利用 NaNBH₃进行还原反应，可能引入大量杂质，从而导致需要额外的纯化步骤，不利于小分子醛类的检测

1.2.2.4环化缩合反应

邻苯二胺可以与芳基醛发生环化缩合反应^[20]，生成咪唑衍生产物。环化缩合反应具有背景干扰小灵敏度高的优点，但该方法只能芳香醛类，不能同时分析包括脂肪醛在内的其它醛类化合物，具有一定的局限性。

1.3醛类化合物检测技术与前处理技术

目前，对醛类化合物测定方法主要有紫外-可见分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法和质谱法。每种研究方法都有其优势， 现在进行分析的方法介绍

1.3.1样品前处理技术

醛类化合物在实际样品中的含量极其微量的，直接对其进行检测是比较困难的。所以，在使用分光光度法分析或色谱法分析时，除了要对醛类化合物进行衍生化处理，还需要对待测样品进行分离、提纯和富集等处理。通常我们使用的分离提纯方式有：液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)。

液液萃取法(LLE)技术是利用原溶剂和萃取剂对于待测物质在其中溶解度或分配系数不同^[21]，使它们在原溶剂和萃取剂中不同地分配，从而实现分离、提纯的目的。

固相萃取法(SPE)技术是液体样品中的待测化合物会被固相吸附剂吸附，再选用合适的洗脱液去进行选择性洗脱，然后达到分离、提纯和富集的目的。

但是，液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)由于繁琐的萃取步骤，人力和时间会被大量的耗费，要去使用大量萃取试剂，这有不符合“绿色化学”的理念。所以，人们提出了两种新型的萃取法，可以使萃取效率有效提高。分别为液液微萃取法(LPME)和固相微萃取法(SPME)。这两种处理方式克服了传统液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)分离提取方式的不足^[22]，使萃取效率极大提高，萃取时间降低了显著降低，萃取剂的用量明显减少，对环境及其环境友好。

对醛类化合物的前处理一般是采用带有衍生试剂的吸附剂同时对醛类化合物进行衍生与富集处理，分离检测最后进行。我们应该注意的是，衍生试剂可能会破坏SPME装置中一般采用的纤维，使其丧失作用，所以该方法使用前，衍生试剂的正确选择尤为重要。

1.3.2紫外-可见分光光度法

紫外可见分光光度法是一种通过样品组分分子吸收200-800m光谱区的辐射来达到分析目的的方法。紫外可见分光光度法具有操作简单、仪器价格相对较低、响应时间快等优点，因此，基层机构常用此法进行检测。使用紫外可见分光光度法分析样品虽然操作简便，但检测限较高，难以满足对不同基质中痕量醛类化合物测量的要求。

1.3.3气相色谱法

气相色谱法(GC)是以惰性气体作为流动相，通过载气(通常是反应活性较差的气体)流经气化室，将气化的样品带入色谱柱中，根据每种化合物在色谱柱中的各自保留时间的不同，达到分离和分析样品的目的。GC法主要用于分析和分离易挥发且不易分解的小分子化合物。

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