摘 要 研究表明银杏双黄酮拥有抗炎、抗癌、神经保护作用、免疫系统调节等诸多药理活性，其需求量的扩大和市面上双黄酮的缺少导致双黄酮提取工艺的重要性不断提高。银杏黄酮中大部分是以黄酮苷的形式存在的，然而对于药理活性而言，黄酮苷元是要优于黄酮苷的。天然产物与无机化合物的配位能够给原始天然物质带来新的药效，单组分银杏生物活性物质与金属离子的配合物具有广阔的研究前景。本文以双黄酮和黄酮苷的制备粗品为原料，利用C18制备柱，对单组分黄酮苷元、单组分双黄酮标样进行了制备。同时将制备所得的单组分黄酮苷元之一的槲皮素作为对象，进行了槲皮素与多种无机金属离子的配合情况探究。 （1）首先利用反溶剂结晶法纯化双黄酮粗品，得到较为纯净的双黄酮待分离样品，将待分离样品进行HPLC色谱分离制备，得到单组分双黄酮：阿曼托黄素、金松双黄酮、异构体银杏黄素与异银杏黄素混合物、白果素四种，采用峰面积归一法得到其纯度：86.13%、97.87%、95.29%、90.23% 。色谱制备条件为：加入0.005mol/L冰醋酸和三氟乙酸改善峰形，上样量10 mL，76%甲醇溶液→甲醇梯度洗脱，洗脱速度20 mL/min。 （2）HPLC法制备分离黄酮苷元，得到单组分黄酮苷元：槲皮素、异鼠李素、山奈酚，纯度皆在85 %以上。色谱制备条件为：流动相中加入0.005 mol/L冰醋酸与0.005 mol/L三氟乙酸的混合物改善峰形，使用60%甲醇等度洗脱、洗脱速度20 mL/min、上样量20 mL。 （3）将制备出的槲皮素与五种金属离子（Fe³ 、Fe² 、Cu² 、Al³ 、Zn² ）按照不同配比0.2-1、0.4-1、0.6-1、0.8-1、1-1、1.2-1、1.4-1、1.6-1、1.8-1、2-1分别在pH=4、6、8、10的缓冲溶液中进行配合反应，运用紫外法检测其螯合情况。结合谱图判断，Zn² 难以与槲皮素发生配合；pH=8 摩尔配比为0.6:1为Cu² 与槲皮素配合的最佳条件；Fe³ 、Fe² 、Al³ 与槲皮素配合的合适条件皆为pH=8，摩尔配比为 1:1 左右。 关键词：银杏生物活性物质；单组分；色谱分离；配合物 Abstract Studies have shown that ginkgo biloba flavonoids possess many pharmacological activities, such as anti-inflammatory, anti-cancer, neuroprotective effect, immune system regulation, etc., and the expansion of its demand and the lack of commercially available biloba flavonoids lead to the increasing importance of the extraction process of biloba flavonoids. Most of the flavonoids in ginkgo biloba are in the form of flavonoid glycosides. However, in terms of pharmacological activity, flavonoid glycosides are superior to flavonoid glycosides. The coordination of natural products and inorganic compounds can bring new efficacy to the original natural substances. In this paper, flavonoid glycosides and flavonoid glycosides were prepared by using C18 column. At the same time, quercetin, one of the flavonoid glycosides, was taken as an object to explore the coordination between quercetin and a variety of inorganic metal ions. First using the double yellow ketone solvent crystallization purification products, is a pure double yellow ketone for separation of the sample, will be HPLC chromatography separation of samples preparation, get the single-component double yellow ketone: Oman flavin, jinsong double yellow ketone, isomer ginkgetin mixture with different ginkgetin, gingko element four, the peak area normalization method is used to get its purity: 86.13%, 97.87%, 95.29%, 90.23%. The chromatographic preparation conditions were as follows: 0.005 mol/L glacial acetic acid and trifluoroacetic acid were added to improve the peak shape, sample volume was 10 mL, 76% methanol solution methanol gradient elution, elution rate was 20 mL/min. Flavonoid glycosides were prepared by HPLC method, and the single component flavonoid glycosides were obtained: quercetin, isorhamnetin and kaempferol. The purity was above 85%. The chromatographic preparation conditions were as follows: the mixture of 0.005 mol/L glacial acetic acid and 0.005 mol/L trifluoroacetic acid was added to the mobile phase to improve the peak shape, and 60% methanol was used for equal elution at a rate of 20 mL/min and 20 mL sample loading. The prepared quercetin was mixed with five metal ions (Fe³ , Fe² , Cu² , Al³ and Zn² ) in a buffer solution of pH=4, 6, 8, and 10 in different proportions, 0.2-1, 0.4-1, 0.6-1, 0.8-1, 1.2-1, 1.2-1, 1.4-1, 1.6-1, 1.8-1, and 2-1, respectively. The chelation was detected by ultraviolet method. Keywords: ginkgo biloba bioactive substance; One component; Chromatographic separation; complexes 目录 摘要 3 Abstract 3 第一章 绪论 5 1.1 银杏简介 5 1.2 黄酮类化合物的医学和药用价值 6 1.3 银杏生物活性成分的提取分离、纯化 7 1.3.1 提取 7 1.3.2 分离纯化 8 1.4 银杏黄酮、双黄酮的配位化学研究进展 11 1.5 研究目的与意义 11 第二章 银杏双黄酮标准样品制备与分离 12 2.1 反溶剂结晶法纯化 12 2.2 HPLC法测定提纯后产品纯度 13 2.3 单组分双黄酮制备分离 13 2.4 银杏中双黄酮的HPLC检测 14 第三章 银杏黄酮苷元标准样品制备与分离及其配位化学研究 16 3.1 银杏黄酮苷元标准样品制备与分离 16 3.1.1 黄酮苷的水解及分离前处理 17 3.1.2 单组分黄酮苷元制备及分离 17 3.1.3 单组分黄酮苷元的HPLC法纯度测定 18 3.2 银杏黄酮的配位化学研究 18 3.2.1 配位机理初步探究 18 3.2.2 槲皮素配合研究 19 3.2.3 紫外检测 19 3.2.5 不同原料配比、pH下的螯合情况探究 22 3.2.6 不同pH下五种金属离子的配合情况 26 第四章 总结与展望 31 参考文献 31 第五章 致谢 33 第1章 绪论 1.1 银杏简介 银杏是这种曾经的大型植物中唯一存活下来的物种部门,所有其他物种都灭绝了。这种植物化石的历史可以追溯到1.8亿年前。因此，银杏叶被称为活化石。尽管关于毫无根据的说法，银杏的介绍以繁体字为主，医学是相对较新的。在最古老的中国草药记载中并没有出现，神农本草经(公元前2800年)^[1]和使用抗咳嗽、哮喘、遗尿、酒精滥用、化脓皮肤感染和肠病毒感染是Li Shih-chen在1596年的《草笔曹康木》中第一次提到^[2]。对叶提取物的处方进行了改进的血液循环，无论是外围的还是中心的，都是从60年代在德国开始的。目前的医疗适应症是间歇性跛行，老年精神衰弱（健忘，早期痴呆，注意力不集中）和耳鸣。银杏提取物如EGb761也被用作替代疗法抗阿尔茨海默病。然而最近，一个大的（3069长期双盲临床试验（6.1年）（“GEM研究”）显示，标准化EGb761提取物没有效果预防任何类型的痴呆。然而，银杏是目前销售和研究最多的药用植物之一。目前还没有准确的全球销售数据，但是在前一次审查中，大致数字为10亿美元引证了DeKosky等人在美国的年度销售数据为2.5亿美元^[3]。这些数据十分容易得到并且被证实，根据SciFinder的搜索，不少于1930篇关于银杏的论文于2006-2007年发表或申请专利，每天超过2次。 银杏叶提取物可分为全叶提取物和叶提取物两种标准化提取物。前者通常用酒精调制并含有所有溶于酒精的成分。后者提取更常见，并且在含有6%的萜烯三内酯（TTLs）中，24%的黄酮醇苷含量低于5 ppm银杏酸。这种萃取物的制备是一个多步骤的过程，但是这可能因制造商而异。在这个过程中一些化合物（TTLs，类黄酮）得到了富集，而其他的（双黄酮，银杏酸）则被去除。通过混合黄酮醇糖苷中含量高、低的批次TTLs可以达到恒定的质量。除了这些需求，原花青素含量，有机酸含量，个体银杏内酯A、B、C、J含量、溶解度、TTLs、黄酮醇苷、有机化合物的定性指纹图谱酸，13C NMR指纹图谱，硫酸盐灰，总有机残留量溶剂，分离残留乙醇和氯化溶剂，微生物污染，黄曲霉毒素，磷的存在和含氯农药，试管试验阳性反应对于特定官能团的存在，pH值各异检查金属种类和颗粒大小。关于银杏叶和标准化叶的专著提取物已经出现或正在为各种药典建设 1.2 黄酮类化合物的医学和药用价值 由于黄酮类化合物丰富众多的结构种类，而且是一类十分重要的拥有多酚类结构的化合物，众多的物质结构使得这类化合物拥有众多的生物活性功能，随着对黄酮类化合物研究的不断发展，其越来越多的药理活性也被发现证实，得到了研究者的高度重视。1962年发表的“The Chemistry of Flavonoid”是其中最早有关黄酮类化合物的研究综述黄酮类化合物。随着研究者对银杏黄酮类化合物研究的不断深入，越来越多的生物活性物质被发掘提取出来，一些新的药理作用诸如肝脏保护作用，免疫调节作用等等也逐渐受到越来越多的重视，其大致药理活性如下。 （1）抗氧化活性 黄酮类化合物自身的抗氧化活性都较强,与人体中的酶、维生素等物质一起是人体中抗氧化物质的主体部分，对人类的健康有着不可忽视的影响。其主要通过自身的还原性、激活抗氧化酶、与金属离子螯合抑制自由基生成、增加其它小分子的抗氧化能力等作用机制达到抗氧化效果。 （2）抗癌活性 黄酮类化合物或者黄酮类化合物衍生物通过对运载蛋白和酶排除的抑制作用，从而实现诸如诱导癌细胞凋亡、抑制其增殖细胞等 （3）保肝作用 黄酮用于治疗肝硬化、急性和慢性肝炎、脂肪肝和由CCl₄和半乳糖胺引起的有毒肝损伤。目前，氢邻苯二甲酸盐被广泛用作肝保护剂，对肝脏疾病，如脂肪肝、肝硬化和肝炎有更显著的治疗作用。氢邻苯二甲酸盐保护肝脏免受各种毒素（四氯化碳、乙醇、乙酰氨基酚和半乳糖）的影响，其作用机制主要包括抑制肝毒素与肝膜受体的结合;刺激RNA聚合酶和核糖体蛋白的合成，从而提高肝细胞的再生能力;有效防止血小板与聚合等的结合 （4）抗心血管疾病 黄酮主要通过降低氧化压力、减少分子炎症信号的表达、抑制血小板聚集和直接舒张压来降低心血管疾病的发生率。研究表明，黄酮类药物可以降低大鼠心脏细胞的强力霉素毒性。富含香味的食物可以预防心血管疾病，茶含有大量的香味，增加茶的摄入量可以降低心血管疾病的风险。 （5）免疫调节作用 黄酮类物质通过对T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、自毁细胞和钛功能的影响，增强机体的免疫功能，调节免疫效应。水性邻苯二甲酸刺激细胞免疫反应，直接影响单核细胞。 （6）抗糖尿病 黄酮在胰腺、肝脏和骨骼肌中通过不同的细胞信号通路发挥抗糖尿病作用。黄酮也会影响细胞的质量和功能，以及周围组织对胰岛素的能量代谢和敏感性。 （7）抗胃溃疡活性 黄酮是胃粘膜的保护剂，抑制胃酸的分泌，降低胃蛋白酶的活性，抑制胃溃疡的产生，促进无毒性溃疡的治疗。 （8）神经保护作用 黄酮保护神经细胞，对缺血性再灌注造成的脑损伤有治疗作用，改善记忆和抗抑郁功能。这些效应是其药理作用的组合，如抗炎药、抗氧化剂、抗凋亡剂和代谢酶调节。 从上述诸多的作用及其作用机制可以看出，银杏中黄酮类化合物对人体的众多调节具有重大效果，对其提取和应用是对药物研究而言不可忽视的部分 1.3 银杏生物活性成分的提取分离、纯化 随着人们探究的深入，银杏叶中的化学成分及药理活性不断明确，1970年左右，国外开始以银杏叶为原料开发出了银杏叶制剂。德国Schwabe公司首次开发并且得到银杏叶提取物“EGB761”及其制剂“金纳多”，在欧美成为了最畅销的银杏保健品之一。目前，国内外开发出的银杏药物已达40余种^[4]，如：金纳多、天保宁、银杏酮酯等，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。目前临床应用的银杏药物主要为复方制剂，但随着对银杏药理活性成分研究的深入，有效药用成分的进一步明确，开发单一有效成分新药成为各国科研人员的新目标^[5-6]。提取分离纯化活性物质是开发制剂的前提，现对银杏中主要生物活性物质黄酮、萜内酯和银杏酸等提取工艺、分离及纯化方法进行总结。

1.3.1 提取

目前天然产物活性物质的提取方法很多，具体见表1-1。溶剂提取法是国内外主要采用的提取方法，具有方便、快速、成本低等优点，常以乙醇、甲醇、丙酮等作为提取溶剂。 表1-1各类提取方法对比

	固液比	温度/℃	提取方式	提取率/%	辅助条件
水浸法	1/26	100	1h*3次	25.9
酮类提取	1/13.5	55	3h/次
乙醇提取	1/5	80	70%乙醇*2h	89.8
负压沸腾提取	1/10	50	70min*2次	93.55	压力-0.08 MPa
微波提取	1/40		1h*1次	91.4	微波
超声提取	1/40	54	20min*1次	97.5	超声功率150w

表1-2 各种提取方法优缺点比较

提纯方法	优点	缺点
有机溶剂法	选择性好，提取率比传统的热水提取法高，工艺简单，易工业化	溶剂用量大，能耗大，提取率低，产品纯度低，易存在溶剂残留
超声波法	溶剂选择性高，操作简单，提取效率高，能耗低，不破坏有效成分	目前实验研究都是处于很小规模，有待于解决工程设备放大的问题
微波法	选择性高、副产物少、提取率高，后处理方便，属于环境友好型	研究还处于初级阶段，提取过程中的参数如估计物理性状及尺寸，水含量等对提取率的影响等
酶解法	提取条件较温和，不破坏有效成分操作简单、能耗低、绿色环保[9]	研究不足，如pH等条件的影响，诸多因素容易破坏酶的活性，试验成功率低
超临界流体萃取法	提取效率高、条件较温和，节能、无溶剂残留	国内研究还不足，设备昂贵，不适于大规模生产

1.3.2 分离纯化

银杏粗提物中一般会含有大量杂质和较低的生物活性成分，无法将得到的提取物应用于实践当中，唯有将有效成分与目标物分离，进一步提高纯度，才能用于后续研究与开发。分离纯化银杏粗提物的方法主要有树脂柱层析法、大孔树脂吸附法、反溶剂结晶法和色谱法、铅铝沉淀等一系列方法。 （1）大孔树脂吸附法