双黄酮的分离及标样制备研究开题报告
2020-10-31 09:11:39
1. 研究目的与意义（文献综述）
1.1目的和意义
银杏（Ginkgo biloba L.）属银杏科，银杏属。又有名为白果、公孙树、鸭脚子等。银杏最早出现于3.45亿年前的石炭纪，曾广泛分布于北半球的欧、亚、美洲，是植物中与恐龙同时代的最古老的孑遗植物，先仅存一科一属一种【1】。在经历第四纪冰川之后，地球突然变冷，绝大多数银杏类濒临于灭种，唯有我国的自然条件优越，生长环境良好，才使得银杏奇迹般的保存了下来，因此科学家称之为植物中的“活化石”、“植物界的熊猫”。其主要分布在中国的温带和亚热带气候区内，虽然国外也有大量分布，但都是直接或间接由中国引入的【2】。
我国银杏大部分分布在北纬19°41’~43°40’，东京97°00’~126°30’，年平均气温在14至18℃，绝对最低气温不低于零下20℃【3】的广大地区，除了黑龙江、青海、西藏以及内蒙古以外，我国各省、区均有分布【4】。我国银杏资源丰富，占世界银杏资源的四分之三以上，其中银杏白果是我国的传统出口产品，仅1997年我国全国白果总产量已经达到1.2万t，全年至少有3.0万t以上的新鲜银杏外种皮，除去水分，干燥的银杏外种皮大约为1.2万t，若按干浸膏为60%计算，则仅外种皮一项就可以生产干浸膏7200t【5】，这是一笔不可忽视的资源。但是，在银杏种植区还有大量的银杏外种皮被种植人员剥下来扔在野外山沟，不仅对河内鱼虾动物有害，还散发着难闻的气味，造成大量的资源浪费与环境污染。
我国每年出口的银杏叶量在1500吨至2000吨之间，出口的GBE在十几吨左右，但是我国目前处于初级阶段，高附加值的终端产品还比较少，开发研究银杏的企业很多，但尚未形成龙头企业。银杏产业在我国会有一个很大的发展空间。
银杏的果实中含有大量的营养物质，其中含粗脂肪2.16%，淀粉62.4%，蔗糖5.2%，还原糖1.1%，核蛋白0.26%，矿物质3%，还还有维生素C、E，核黄素，胡萝卜素等，还含有17种氨基酸，黄酮，白果醇以及微量元素Fe、Cu、Mn、Zn和常量元素Ca、Mg等【6】。白果具有杀菌，美容养颜，止咳祛疾等功效，具有很高的使用价值。但白果种也含有一些小毒酚酸类物质，医药界认为，生白果应控制一天食用10粒左右，过量食用会引起腹痛、发烧、呕吐等症状【7】，在制作银杏果类产品时，如何高效地将银杏果种的酚酸分离出来一直是现代科学界讨论的热点。银杏叶和银杏外种皮是很好的制药原料，楼凤昌【8】等从银杏外种皮的乙酸乙酯、丙酮和正丁醇提取物中，分出了8个结晶，经波谱分析再与标准图谱作对照，分别鉴定出为：胡萝卜甙、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、儿茶酚、金松双黄酮、银杏黄素、异银杏黄素、原儿茶素。银杏叶中含有40余种黄酮类化合物【9】还含有萜内酯类化合物、酚酸类化合物、甾类【10】、糖和糖醇以及微量元素。银杏黄酮类化合物以其特殊的药理活性近几年一直倍受科学界关注，双黄酮类化合物作为黄酮类化合物的一种却鲜有报道，如何高效以及高纯度地分离纯化双黄酮类化合物一直是目前银杏类研究者们所探讨的。
1.2国内外研究现状
1.2.1天然黄酮类化合物
黄酮类化合物是指具有C6—C3—C6结构的酚类化合物【11】，具有两个芳香环，环间通过中央三碳连接。目前已知的天然黄酮类化合物已经超过5000多种【12】，不仅广泛存在于高等植物，也存在于许多低等植物中，尤其以芸香科，石南科，唇形科，豆科等高等植物中分布较多。黄酮类化合物以其广泛分布以及独特的药用作用而备受现代科学家的关注，其中最早有关黄酮类化合物的综述报道是1962年的“The Chemistry of Flavonoid”。
1.2.1.1不同黄酮类化合物结构
表1-1不同黄酮类化合物结构
| 类型 | 基本结构 | 代表化合物 |
| 黄酮（flavone) | 木犀草素 | |
| 黄酮醇（flavonal) |
| 槲皮素 |
| 二氢黄酮（dihydraflavone) | 甘草苷 | |
| 二氢黄酮醇（dihydraflavonal) | 黄柏素-7-O-葡萄糖甙 | |
| 异黄酮（isoflavone) | 葛根素 | |
| 二氢异黄酮（dihydroisoflavone) | 紫檀素 | |
| 查耳酮（chalcone) | 异甘草素 | |
| 二氢查耳酮（dihydrochalcone) | 梨根甙 | |
| 花青素（anthocyanidin) | 天竺葵素 | |
| 黄烷-3-醇（flavan-3-ol） | 儿茶素 | |
| 黄烷-3,4-醇（flavan-3,4-diol) | 无色矢车菊素 | |
| 双苯吡喃酮（xanthone) | 异芒果素 | |
| 橙酮（aurone) | 硫磺菊素 |
1.2.1.2黄酮类化合物的功能作用
（1）抗氧化作用
黄酮类化合物在A、B环上都有多酚羟基，在C2与C3之间有双键、C4为酮羰基，都具有潜在的抗氧化活性。它们的羰基和3位或5位羟基联合作用，可以螯合金属离子。研究表明黄酮类化合物可以通过作用于与自由基有关的酶、阻断自由基链的传递过程、与诱导氧化的过渡金属离子络合等方式起到抗氧化的作用。
（2）增强免疫调节功能
银杏黄酮能在一定范围内明显促进淋巴细胞的增殖反应，经王雪芹【13】总结，发现黄酮类化合物能够增强诱导淋巴细胞产生白细胞介素和干扰素、增强腹腔巨噬细胞的吞噬功、增强巴细胞线粒体脱氢酶和中性粒细胞国氧化物酶的释放、保护骨骼肌细胞膜的正常结构和功能，降低运动后急性免疫反应等来增强免疫功能作用。
（3）抗衰老和抗疲劳作用
黄酮的抗衰老作用是多方面的，它可以调整中枢神经系统的功能、调整内分泌系统的功能、调节免疫功能、消除自由基作用和抗肿瘤作用等。多数研究都表明其生理活性是以黄酮类化合物的抗氧化活性为基础的，与抗自由基或抗脂质过氧化有关。
经研究的证明，黄酮类化合物具有一定的抗疲劳作用。谢伟【14】等研究了银杏黄酮对骨骼肌抗疲劳能力的影响，结果表明，中、高浓度的银杏黄酮能有效对抗肌肉疲劳。
（4）抗菌抑菌作用
Gould【15】指出，酚类物质可通过破坏细胞壁以及细胞膜的完整性，导致微生物细胞释放胞内成分，进而引起膜的电子传递、营养吸收、核苷酸的合成以及影响ATP的活性，从而抑制微生物的生长。
黄酮类化合物的化学结构属于酚类衍生物，因而也具有上述特性，也能表现出一定的抑菌作用。曲晓华【16】选用不同浓度的银杏提取物的高压灭菌培养基，研究对不同细菌的抑菌作用。
（5）抗肿瘤作用
抗肿瘤活性是黄酮类化合物药理作用的另一个研究热点。黄酮类化合物主要通过抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制癌基因表达等起到抗肿瘤作用。在近几年的研究中，高媛【17】研究注射银杏黄酮7d后小鼠的淋巴细胞增殖情况，研究结果表明银杏黄酮可防护环磷酰胺的致畸变作用，对体内体外肿瘤细胞的增殖均具有抑制作用。刘心平【18】等采用逆转录-聚合酶链式反应（PT-PCR）方法检测显示，银杏黄酮能使癌细胞水平下降。张凤【19】等提取并测定了银杏叶类黄酮的含量，并研究了银杏叶黄酮对体外培养的人胃癌细胞BGC823的增殖抑制作用。但是，黄酮类化合物抑制癌细胞生长的具体机制还不是十分的明确，有待进一步研究。
（6）降血脂作用
黄酮类化合物由于具有显著的清除自由基和抗氧化作用，因此可以改善脂质的代谢，降低升高了的血脂水平，阻止脂质过氧化的链式扩增反应，延缓AS的发生。
1.2.2银杏中的提取物及发展
1.2.2.1银杏提取物的发现及发展
1928年日本川村从白果仁中分离出白果酸、白果醇和白果酚三种物质。
日本古川周二于1932年首次从银杏叶中提取了双黄酮类物质，并证实这类物质具有扩张血管的功能。
1941年日本中泽浩一从银杏叶提取物中分离出银杏黄素【20】，并认定其分子式为C32H22O10。随后，Borke等【21】又用逆流分离法从银杏黄素的混合物中分离了3中双黄酮，除了银杏黄素外，还有异银杏黄素和白果黄素，并于1959年测出了这些化合物的结构式。
后来，科学家们又从银杏叶提取物中发现了另一种物质，叫做萜内酯类。这类物质在治疗疾病中起着更加重要的作用。实验表明，萜内酯类化合物与黄酮类化合物要保持一定的比例，才能充分发挥各种成分的作用，取得最佳的医疗效果。有科学家经过反复试验，认为采取第761号的比例能取得最好的效果，因此银杏提取物也称为“GBE761”。
直至20世纪60年代末，我国制药业才开始对银杏叶的开发利用，1969年11月，中国科学院植物研究所和北京制药厂联合推出银杏叶提取片剂，主要用于治疗心血管疾病；以及银杏叶提取物针剂，用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病和心绞痛等疾病。由于当时的技术问题，所提取的银杏提取物有效成分低并且不稳定，含有较多的银杏酸和银杏酚等杂质，而且主要提取的是黄酮类而忽略了内酯类的提取，临床疗效差，最终该产品在市场上消失了。到20世纪80年代初首次从银杏叶中提取药用原料【22】，落后于发达国家约20多年，这也是为什么我国虽然拥有丰富的银杏资源却不是银杏叶提取物的最大销售市场。1993年，由多名专家和学者联合成立的课题小组研制出了我国首款银杏小分子口服液制剂，该产品采用三级萃取技术，对心脑血管的保护作用是普通银杏制剂的3~8倍，被称为“心脑血管保护神”。
现在，国外用于制造药物的标准银杏叶提取物是：黄酮类物质含量为24%，萜内酯类物质含量为6%，酚酸含量不高于5ppm【23】。
1.2.2.2银杏中的黄酮及其研究发展
表1-2 银杏中黄酮类种类
| 黄酮种类 | 种数 | 成分 |
| 黄酮醇及其甙 | 22 | 分为黄酮醇单甙、黄酮醇双甙、黄酮醇三甙以及新黄酮醇香豆酸酯甙四大类 |
| 黄酮及其甙 | 7 | 槲皮素（quercetin)、山奈素（keampferol)、异鼠李素（isorhamnetin)、杨梅素（myricetin)、芹菜素（apigenin)、木犀草素（luteolin)、三粒小麦黄酮（tricetin) |
| 黄烷醇 | 6 | 儿茶素（catechin)、表儿茶素（epicatechin)、没食子酸儿茶素（gallocatechin)、表没食子儿茶素（epigallcatechin)、4-8’’-儿茶素没食子儿茶素（4-8’’-catechingallocatechin)、4-8’’-没食子儿茶素没食子儿茶素（4-8’’-gallocatechingallocatechin) |
| 双黄酮 | 6 | 银杏素（ginkgein）、异银杏素（isoginkgein)、穗花杉双黄酮（amentoflavone)、金松双黄酮（sciadoputydin)、白果素（bilotetin)、5’-甲氧基去甲银杏双黄酮（5’-methoxybilobetin) |
银杏叶黄酮类化合物的研究始于本世纪30年代，1932年，日本学者古川周二首先从银杏中提取到银杏双黄酮的混合物，1941年Baker等应用逆流分配色谱法从银杏双黄酮混合物中分离出银杏黄素、异银杏黄素和白果素，之后，松本武等、游松。陈云龙及Hasler等先后进行了银杏叶黄酮的分离机结构鉴定的研究工作【24】。
银杏中黄酮类化合物的提取方法有丙酮法、乙醇法、色谱法、酶法等。其中，酮、醇提取法是相当经典的方法，用酮、醇提取后再用其他方法净化，是近年来广泛采用的。
1.2.2.3银杏中萜内酯化合物及其研究发展
萜内酯类化合物是银杏叶中另一类重要的药效成分。1932年Furukawa首次从银杏叶子中分离出了银杏内酯，但直到三十五年后的1967年才由K.Nakanishi【25】、K.Okabe【26】、M.Maruyama【27】等人用光谱法解释了4种银杏内酯的结构。后来又用X射线结晶和核磁共振法证实了这些银杏内酯的结构（如图）。其中取代基R1~R3列于下表
图1-1银杏内酯结构
表1-3银杏内酯结构
| 银杏内酯 | R1 | R2 | R3 |
| 银杏内酯A | OH | H | H |
| 银杏内酯B | OH | OH | H |
| 银杏内酯C | OH | OH | OH |
| 银杏内酯M | H | OH | OH |
| 银杏内酯J | OH | H | OH |
| 银杏内酯A异构体 | H | OH | H |
| 银杏内酯A异构体 | H | H | OH |
1.2.3双黄酮及其研究进展
1.2.3.1双黄酮的药理作用
（1）抗癌作用
詹华强【30】等的研究中表明，双黄酮化合物中的银杏双黄酮对A549非小细胞癌具有较强的细胞毒性作用。可以抑制此种细胞的肿瘤生长和诱导此种细胞的凋亡，由此可见银杏双黄酮可以用于制备预防和治疗肺癌的药品或者是保健品。
孙颖桢【31】等研究出双黄酮化合物对某种肝癌细胞的生长具有抑制作用，并且抑制率与时间、双黄酮化合物的浓度成正比例增长。
陈晓华【32】研究了狼毒根中的一种新的双黄酮葡萄糖苷通过SRB测定对四种人的癌细胞具有细胞活性。
异银杏黄素可以作为前mRNA剪切抑制剂，可为抗肿瘤剂的开发提供新途径【33】。
（2）抗炎作用
吴彤【34】等从银杏叶中提取分离的一种银杏黄素化合物可以用于制备预防或是治疗关节炎等疾病的药物，此发明发现了该种银杏黄素类化合物对关节炎，特别是对类风湿关节炎表现出了很好的抑制活性。
Lim H【35】等采用慢性皮肤炎等动物模型研究了银杏黄素的抗炎作用及其对前炎基因的表达，结果表明银杏黄素能够明显减轻小鼠耳部肿胀，表皮增生等炎症反应，且受银杏黄素的剂量影响。
（3）保护作用
张震【36】等在研究阿曼托双黄酮（AF）对小鼠癫痫模型的影响中，得出阿曼托黄素具有明显的预防惊厥发生以及保护神经的作用，其药理机制与AF抑制癫痫发生时的脑内炎性反应有关。
一种葫芦科种子中的双黄酮可以通过调节存活和凋亡信号缓解动物脑缺血【37】。
1.2.3.2双黄酮的研究进展
至2014年为止，已经从银杏叶中分离鉴定了6中双黄酮类成分，其中7中是苷元，分别为金松双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、去甲银杏双黄酮、1-5’-甲氧基白果素、三羟基黄酮、2,3-二氢金松素，双黄酮苷有两种，分别为银杏黄素-7″-O-β-D-吡喃葡糖苷和异银杏黄素-7″-O-β-D-吡喃葡糖苷。银杏叶中主要的双黄酮成分为金松双黄酮、银杏双黄酮、异银杏双黄酮和去甲银杏双黄酮。
图1-2银杏中主要双黄酮结构
1932年古河【38】从秋天采集的银杏叶中分离出了黄色色素，然后于1963年Baker【39】运用逆流分配法分离到银杏黄素和异银杏黄素，运用UV、IR和化学讲解法确定了它们的结构。
中国据记载的文献中，最早开始研究银杏双黄酮的是周日秀【40】等对“庐山银杏科植物银杏叶中提取的银杏叶Ⅰ号，进一步分离得三个结晶，分别定名为银杏叶甲、乙、丙素，经理化以及光谱分析鉴定。甲为金松双黄酮，乙为异银杏双黄酮，丙的含量过少而未分离鉴定完全。
1.2.3.3双黄酮的提取
（1）有机溶剂提取法
有机溶剂提取法在国内外是使用最为广泛的一种提取方法，其中用于提取黄酮类化合物的溶剂主要为乙醇和甲醇，高浓度的醇（如90%~95%）有利于提取苷元，浓度为60%的乙醇或者甲醇水溶液适用于提取苷类物质。
韩学哲【41】等利用乙醇-水混合溶剂循环提取银杏叶中的黄酮。通过实验对提取工艺的条件进行优化，提取溶剂为70%的乙醇，提取温度为65℃，料液比1:5，提取次数为3次。再经过精制后可得到含量为24%的精制银杏黄酮。
（2）水浸提法
黄酮类成分大多具有酚羟基，具有易溶于碱性水而难溶于酸性水的性质，可用碱性水浸出，再加酸酸化析出。在加碱性溶剂提取时，所用的碱浓度不宜过高，以免破坏化合物。水浸提法可以有效地降低成本，并且水提法更加环保、安全。
戴余军【42】等研究了NaOH溶液提取银杏叶总黄酮，实验中不同浓度的NaOH对黄酮的提取有显著的影响。刘金香【43】等用碱溶酸沉法提取银杏叶总黄酮，碱法提取95℃用40倍量pH=10.0的NaOH溶液提取60min，然后用pH=3.5的HCl酸沉，得到黄酮提取率较单一水提有所上升。
（3）微波提取法
微波提取法具有提取率高、快速、操作成本低等优点。其提取原理是微波升温加热后可导致细胞内的极性物质，特别是水分子由于吸收微波而产生了大量的热能，使细胞内的温度迅速上升，导致细胞壁和细胞内部水分降低，细胞皱缩，表明孔系增加，使溶剂很容易进入细胞内溶解并释放出细胞内的产物，从而达到提取的效果。
微波技术用于中药有效成分的提取，可以克服传统提取方法的一些缺陷，可以缩短时间，降低能源溶剂消耗，提高收率和提取物纯度，也符合环境保护的要求。
（4）超声提取法
超声波提取技术是利用超声波的强振动，高速冲击来破坏提取物细胞结构，使溶剂渗入细胞内部，从而加速有效成分的溶解，进而达到提取的目的。
辛春斌【44】等以70%乙醇为介质，对银杏黄酮进行微波和超声波强化萃取，与传统溶剂溶剂提取法提取黄酮作比较，结果表明此种方法操作简便，高效，并且只用传统方法的1/20~1/40的时间就可以达到相同的提取效果。
1.2.3.4双黄酮的分离方法
（1）硅胶柱层析
目前双黄酮的分离大都采用硅胶柱分离。根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况是极性大的物质容易被硅胶吸附，极性弱的不容易被吸附。流动相一般极性小的采用乙酸乙酯-石油醚；极性较大的采用甲醇-氯仿，极性大的采用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统。
1983年周日秀【40】等用甲苯湿法装柱，以甲苯：乙酸乙酯=8:2，然后以甲苯：乙酸乙酯：甲酸=5:4:1进行洗脱分离出金松双黄酮和异银杏黄素。
李冰【45】等采用硅胶柱色谱和半制备液相色谱对各种双黄酮进行制备，并采用HPLC进行测定，在对变黄前后银杏叶中的4种测定中，叶子自然变黄的前三周内，双黄酮含量呈递减状态。
（2）聚酰胺薄板
对黄酮类化合物来讲，聚酰胺是较为理想的吸附剂。聚酰胺薄板能分离黄酮类化合物的原理是黄酮类化合物中羟基数目与位置不同，导致不同种黄酮类与聚酰胺之间形成的氢键的缔合能力不同，从而分离黄酮类化合物。
目前研究中，钟郁青【46】等采用先过硅胶柱，然后再在聚酰胺薄板上用甲醇：乙酸乙酯：甲酸=3.0:1.8:0.2进行展开分离。再经TLC、紫外、质谱、高效液相色谱检测出银杏黄素，异银杏黄素，白果素。
（3）高速及高效逆流色谱法（HSCCC)
高速逆流色谱法（HSCCC)是一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，与一般的色谱技术不同之处在于HSCCC没有固态载体，能减少样品的污染、失活或者变性。HSCCC的溶剂系统是由两种互不相容的溶剂组成，依靠聚四氟乙烯蛇形管的方向性和特定的高速行星式旋转所产生的离心场作用，两种溶剂分别担任流动相和固定相，由于所测各组分在两相中的分配能力不同，在蛇形管内的移动速度不同，从而使样品组分得到分离，一般分离比较完全。
袁媛【47】采用HSCCC技术从卷柏中分离得到6种化合物：阿曼托双黄酮，罗伯茨双黄酮，白果素，扁柏双黄酮和异柳杉双黄酮和一种芹菜素双葡萄糖苷。
李佳莲【48】采用HSCCC技术从麻黄中分离得到2个双黄酮和2个黄酮。
1.2.3.4双黄酮的纯化
（1）硅胶柱层析
纯化原理同分离原理类似，进一步分离极性有差距的化合物。
Sam【49】等采用不同浓度的洗脱剂上柱进行梯度洗脱，多次重复分离出银杏黄素和异银杏黄素，并对其进行了结构鉴定。
孔繁晟【50】等结合硅胶色谱和重结晶方法对银杏叶乙醇提取物进行分离纯化，制备得出金松双黄酮对照品，质量分数较高。
（2）制备型高效液相色谱
制备型高效液相色谱相当于分析型液相色谱的放大，一般在分析液相中进样量是微克级甚至更低。在这种情况下，所进样会达到很好的分离效果。而在制备型高效液相色谱中，进样量可达几十毫升，从而达到分离样品的较高量且高纯度的分离纯化。
魏丽娜【51】在采用制备型高效液相色谱分离穗花杉双黄酮粗品时，以甲醇：0.1%TFA作流动相，10mL/min流速、检测波长为337nm的条件下，分离精制后的产品纯度可达99.2%，回收率可达94.7%。
但目前未发现将制备型高效液相色谱应用于分离纯化银杏提取物中的双黄酮。
2. 研究的基本内容与方案
2.1基本内容
（1）测定银杏叶中双黄酮的含量。
（2）提取银杏叶中的双黄酮并通过硅胶柱进行分离，采用制备型高效液相色谱进行纯化。
3. 研究计划与安排
第1——3周：查阅相关文献，了解课题背景知识、概念及研究进展。拟定研究方案，完成开题报告。
第3 ——6周：ppt讲解并论证研究方案。
第6 ——15周：根据实验方案进行实验，探讨实验结果、得出结论。
4. 参考文献（12篇以上）
【1】曾新萍，黄志明，黄维南，郑晓倩. 银杏综合开发利用[j].亚热带植物通讯 2000,29（3）;58-63.
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