摘 要

糖基化作为一种重要的蛋白质修饰手段，在生物体诸多生理活动中起着至关重要的作用，而且与疾病的发生发展紧密相关。于是，对生物体中聚糖的进行检测分析具有重要意义。然而，生物体系的复杂多变、高灵敏度检测手段的缺乏都给聚糖的检测带来困难。

本文论述了一种基于HPLC-FD和LC-MS检测的新型荧光试剂AOEC（4-胺氧基-6-乙基-7-羟基香豆素）对聚糖衍生后进行检测的方法。我们检测了AOEC的荧光性质，以麦芽七糖作为模型聚糖、衍生产物HPLC-FD色谱峰面积为评价标准对反应体系进行了条件优化，在最优条件下将该方法运用到低聚果糖的检测中，初步检测到三种低聚果糖成分。

结果证明，AOEC具有良好的荧光性能，通过肟化反应衍生到聚糖后赋予其荧光性的同时能增强其疏水性，使聚糖能同时适应于荧光和质谱检测，并达到较高的灵敏度。

关键词：聚糖；AOEC；荧光衍生；HPLC-FD；LC-MS

Abstract

As an important means of protein modification, glycosylation plays an important role in many physiological activities, and is closely related to disease development. Thus, the detection of glycan in the organism is of great significance.However, there still remains some difficulties for glycans’ detection so far, such as the complexity of the biological system and the lack of high sensitivity detection means.

In this paper, we developed a derivatization strategy of glycans using a novel fluorochemical reagent which based on HPLC-FD and LC-MS detection.We have developed the fluorescence properties of AOEC, and the reaction conditions of the reaction system were optimized by using maltose as model glycogen and using the HPLC-FD peak area as the evaluation standard. In the optimum conditions, the method was applied in the detection of fructooligosaccharides. In this test, three oligofructose fractions were initially detected.

The results show that AOEC has good fluorescence properties, and it can enhance the hydrophobicity and fluorescence properties of glycans through oximation reaction so that the polysaccharide can adapt to both fluorescence detection and mass spectrometry and achieve high detection sensitivity at the same time.

Key words: glycans; AOEC; Fluorescence Derivation; HPLC-FD; LC-MS

目录

第一章 绪论 1

1.1 糖组学研究意义 1

1.1.1 糖组学概述 1

1.1.2 糖基化作用与疾病 1

1.2 基于质谱的糖链检测 2

1.2.1 糖链的释放与纯化 2

1.2.2 糖链的衍生 3

1.2.3 糖链的检测 5

1.3 聚糖的稳定同位素标记法 6

1.4 本文研究内容及创新 7

第2章 基于香豆素类试剂的麦芽七糖衍生反应 10

2.1 引言 10

2.2 实验部分 11

2.2.1实验材料与仪器 11

2.2.2实验试剂 12

2.2.3 实验步骤 12

2.3 结果与讨论 16

2.3.1 AOEC荧光性质的测定 16

2.3.2 色谱中麦芽七糖与AOEC衍生反应产物峰的确定 19

2.3.3 麦芽七糖与AOEC衍生反应条件的优化 20

2.3.4 荧光衍生产物的还原氢化以及产物的质谱测定 23

2.3.5 d0-AOEC、d6-AOEC与模型聚糖的衍生产物质谱结果分析 25

2.4 小结 26

第三章 基于HPLC-FD和LC-MS检测的AOEC在低聚果糖中的应用 27

3.1 引言 27

3.2 实验部分 28

3.2.1实验材料与仪器 28

3.2.2实验试剂 29

3.2.3 结果与讨论 30

3.3 小结 32

第四章 基于LC-MS检测的AOEC在RNase B中的应用探索 33

4.1 前言 33

4.2 实验部分 33

4.2.1 实验仪器 33

4.2.2 实验试剂 34

4.2.3 实验步骤 34

4.2.4 结果与讨论 35

4.3 小结 36

第五章 总结与展望 37

参考文献 38

致谢 41

第一章 绪论

1.1 糖组学研究意义

1.1.1 糖组学概述

糖类是细胞6种基本组分之一，并参与许多重要生物过程，包括细胞粘附、分子的运输和清除、受体激活、信号传导和胞吞作用等^[1]，同时，生物体中的糖类与疾病紧密相关，因此糖类研究具有重大意义。

近几十年来，生物学家们已逐步了解了生物体中糖类及其衍生物的生物合成途径以及它们与多肽链的连接方式，并对它们在生理活动中所起的作用进行了诸多研究，这些研究逐渐促进形成了一门新的学科——糖组学。糖组学的主要研究对象是聚糖，聚糖即形成糖蛋白（glycoprotein）和糖脂（glycolipid）中的杂聚的糖部分^[2]。糖组学作为分子细胞生物学最后的未发掘的前沿学科，主要针对涉及单个个体的全部糖蛋白的结构分析。

1.1.2 糖基化作用与疾病

糖组学研究主要围绕聚糖的结构和功能两个方面展开，其中糖基化作用是研究的重点之一^[3-5]。糖类在糖基转移酶的作用下转移到蛋白质或者脂质上，然后与蛋白质的氨基酸残基形成糖苷键，这个过程称为糖基化作用。