摘 要

天然多糖广泛存在于动植物及微生物中，参与人体及其他生物的重要的生命过程。多糖具有结构相似性，且没有光吸收基团和发色基团，无法用紫外或荧光等光谱的检测方法监测。所以，糖类的分离和检测都有难度。但多糖的还原末端可用化学合成方法引入含有紫外吸收或荧光的基团，这在方便了多糖分子的检测的同时，也方便了糖分子的分离。具有荧光性能的羟胺能在温和条件下满足上述条件。

利用多糖分子还原端的醛基与羟胺基的反应，实现了多糖分子的荧光标记。本文主要介绍一种新的含有香豆素母环的N-取代羟胺化合物的路线设计、合成、纯化及表征。

关键词：香豆素化合物；荧光标记；7-甲氧基香豆素长链羟胺；多糖标记

Abstract

Natural polysaccharides widely exist in animals, plants and microorganisms, participating in important biological processes of many living organisms including human.Polysaccharides have similar structures and have no light absorption groups or chromophore, which makes it unable to use ultraviolet and fluorescence spectrum to monitor the procedures. Thus both the separation and detection of polysaccharides are difficult. However, most polysaccharides’ reducing end can link with functional groups with ultraviolet absorption or fluorescence by certain synthetic method, which makes the detection and separation of polysaccharides convenient. Fluorescent hydroxylamine can satisfy afore-mentioned conditions under mild conditions.

Taking advantage of the ligation between the aldehyde group on polysaccharides and the hydroxyamino group on fluorescent compounds, polysaccharides can be easily tagged under mild condition. This project mainly introduce the route design, synthesis, purification and characterization of a new N - hydroxylamine compound with coumarin ring.

key words: Coumarin compounds；Fluorescent tags；4-(4-(hydroxyamino)butyl)-7-methoxy- coumarin ; Polysaccharide tag

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2糖类的标记 1

1.2.1糖类研究限制及解决方案 1

1.2.2 糖类标记方法 2

1.3 荧光标记试剂 3

1.3.1 荧光原理及标记试剂 3

1.3.2 香豆素荧光试剂 4

1.4 羟胺化合物 5

1.4.1 羟胺化合物用于糖标记 5

1.4.2 羟胺基的引入方法 6

第二章7-甲氧基长链香豆素羟胺的合成与纯化 8

2.1 引言 8

2.2 实验方案 8

2.3 合成与纯化 9

2.4 实验药品和仪器 12

2.4.1 药品 12

2.4.2 仪器 13

2.5 图谱分析 14

2.5.1 化合物4的图谱分析 14

2.5.2 化合物5的图谱分析 16

2.5.3 化合物6的图谱分析 18

2.5.4 化合物7的图谱分析 20

2.5.5 化合物8的图谱分析 22

第三章 结果与讨论 26

参考文献 29

致 谢 31

第一章 绪论

1.1 引言

天然的多糖广泛的存在于动物、植物及微生物中，并参与到人体及其他生物的各种重要的生命过程中，尤其在维持生命体机能等相关方面扮演着重要的角色，是自然界生物体中不可或缺的组成成分^[1]。

近年来，随着对糖类物质生物功能相关研究的不断深入和突破以及糖类衍生化及检测方式的不断发展，关于糖的研究现已经成为化学和生物学领域新的研究热点^[2]。

目前，对糖类分离检测的方式主要是衍生化法，其又分为柱前衍生化法和柱后衍生化法。由于柱前衍生化法具有较高的衍生效率，其仍是糖类物质分离分析中主流的方法之一。所谓柱前衍生，就是先将糖类样品衍生化,即通过化学反应的方式对原有样品进行有目的性的修饰，然后根据衍生物的性质进行色谱分离并检测的方法^[3]。该方法较柱后衍生或其他方法还具有：（1）不需要考虑衍生反应的动力学因素。（2）所需的衍生化试剂、反应条件和反应时间的选择不会受到色谱系统条件的限制。（3）没有附加仪器设备的要求，使色谱分离过程复杂化。但柱前衍生化法同样存在着缺点，如衍生化的操作过程较繁琐、容易影响定量分析的准确性，同时，衍生反应形成的副产物可能对色谱分离造成较大干扰从而影响分析结果，所以寻求一种好的衍生化试剂对糖类的研究具有重要意义。

本研究的重点就是合成一种用于多糖标记的荧光化合物，希望通过寻求一种较好的衍生化试剂来改善多糖的分离与检测，促进相关研究的发展以及促进对多糖在生命进程中作用的研究。

1.2糖类的标记

1.2.1糖类研究限制及解决方案

糖类物质在自然界的储量极为丰富，是除蛋白质和核酸之外的另一类重要的生物大分子。但人们对糖类物质的研究进展较蛋白质和核酸却远远落后，这与糖类糖种类繁多，结构复杂而且多为异构体，存在着微观不均一性等性质有关，这些性质增加了对糖类相关研究的难度^[4]。

目前，已经知到的天然多糖便有300多种，多糖是由醛单糖或酮单糖通过糖苷键连接成的天然高分子化合物。正是由于多糖是通过相似的结构单元以糖苷键重复连接而成，致使其结构具有很强的相似性，从而也极大增加了其种类的多样性。糖类一般没有可见光吸收，紫外区也仅在190-210 nm处有微弱的吸收，只能测量到毫摩尔级水平^[5,6]。然而，对于一些痕量多糖的检测与研究而言，这些条件的存在，将大大阻碍其研究发展。所以，对于分析化学家来说，复杂糖化合物的结构解析仍是一个极具挑战性的课题。研究者不得不寻求一种新的方式来解决之一问题，衍生化便是其中一种重要方式。

对于没有光吸收基团和发色基团的多糖而言，灵敏度较高的紫外或荧光等光谱的检测方法不适应，而像反相高效液相色谱法、示差折光器和脉冲安培检测器等虽然可用于天然糖的检测，但是灵敏的不足以检测多种生物体系中的低浓度聚糖，所以多糖的分离和检测都有难度。大多数的光谱检测器都不适应，但多数多糖都存在还原末端，可以通过化学合成的方法引入含有紫外吸收或荧光的结构，即通过化学衍生的方法使糖分子带上发光基团。糖类分子被荧光试剂标记后，能够在荧光显微镜下成像，在对其专一性影响较小的前提下提高了糖类在高效液相色谱中的检测灵敏度；经过标记的糖类分子结构上发生了改变，其极性也随之变化，使原本难以分离的成分可以使用简单分离方法分离。所以种方法不仅解决了糖分子没有发光基团光谱检测难得问题，同时，也解决了糖分子的分离，可谓一举两得^[4,7,8]。