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摘 要

亚硝酰氢(HNO)是一氧化氮(NO)单电子还原和质子化的衍生物，并且具有不同于NO的特征性生物学和药理学效应。然而，其生物合成和活性的研究因为缺乏适用于活细胞的多功能的HNO检测方法而受到限制。在此，我们报告一种新型的适用于检测活细胞中HNO的分子荧光探针——铜基多臂羧酸罗丹明荧光探针。由于罗丹明和铜基多臂羧酸同时具有光学、EPR和易与稀土配位组装的特性，能够拓展罗丹明探针应用于稀土纳米检测方法。我们通过溴代偶联反应将多臂羧酸烷基链连接在氨基水杨醛上，可以制得多臂羧酸的易配位罗丹明探针平台。本实验设计并合成多臂羧酸罗丹明和铜盐的螯合物，并通过¹H-NMR、¹³ C-NMR等分析方法对其合成步骤中间体以及目标产物的结构进行表征，为铜基多臂羧酸罗丹明纳米探针的合成作前期准备。

该探针主要基于通过HNO还原Cu（II）至Cu（I），从而达到检测HNO的目的。与先前的HNO探针相比，铜基多臂羧酸分子荧光探针因其多臂羧酸的存在，显著增加了纳米分子的负载量，使得分子荧光探针在活细胞中的稳定性与灵敏度得到提高。

关键词：硝基(HNO)检测 多臂羧酸 罗丹明 荧光探针

Abstract

Nitroxyl (HNO) is a one-electron reduced and protonated derivative of nitric oxide (NO) and has character-istic biological and pharmacological effects distinct from those of NO. However, studies of its biosynthesis and activities are restricted by the lack of versatile HNO detection methods applicable to living cells. Here, We report a novel molecular fluorescent probe suitable for the detection of HNO in living cells,Copper-based multi-arm carboxylic acid rhodamine fluorescent probe.Because Rhodamine and copper-based multi-arm carboxylic acids have the characteristics of optical, EPR and easy coordination with rare earth coordination at the same time,rhodamine probe can be extended to the rare earth nano-detection method.We linked the poly-carboxylic acid alkyl chain to the amino salicylaldehyde by the bromination coupling reaction,which prepared Multi - armic acid and easy - coordinated rhodamine probe platform.The chelate compounds of multi-arm carboxylic acid rhodamine with copper ions were designed and synthesized in the experiment, And the structure of the product and the intermediate of the synthesis step were verified by1H-NMR, 13C-NMR,for the synthesis of Copper - based Poly - Carboxylic Acid Rhodamine Nanoparticles prepared for pre-synthesis.

The probe is mainly based on the reduction of Cu (II) to Cu (I) by HNO, so as to achieve the purpose of detecting HNO.Compared with the previous HNO probe, the copper-based poly-carboxylic acid molecular fluorescent probe significantly increases the loading of the nanomolecules due to the presence of its multi-arm carboxylic acid, which makes the stability and sensitivity of the molecular fluorescent probe in living cells is improved.

KeyWords: Nitroxyl detection; Multi-arm carboxylic acid ; Rhodamine; Fluorescent probe

目 录

摘 要 II

Abstract III

目 录 IV

第一章 文献综述 6

1.1引言 6

1.2 HNO检测发展进程 8

1.2.1铜基荧光探针 8

1.2.2基于膦的荧光探针 10

1.2.3基于TEMPOL的荧光探针 13

1.2.4 非荧光方法进行HNO检测 14

1.3课题来源 15

第二章 实验部分 16

2.1主要试剂和容器 16

2.1.1实验仪器 16

2.1.2溶剂及化学试剂 16

2.2实验步骤设计 17

2.2.1 罗丹明酰肼的合成 17

2.2.2 多臂羧酸罗丹明Cu² 螯合物的合成 18

第三章 结果与讨论 20

3.1目标产物氢核磁共振图（¹H-NMR）表征 20

3.1.1化合物1a罗丹明B酰肼的¹H-NMR图谱： 20

3.1.2化合物1 2,2'-（（3-羟基己二烯基）二烷基）二乙酸二乙酯 的¹H-NMR图谱： 21

3.1.3化合物2 2,2'-（（4-甲酰基-3-羟基苯基）二烷基）二乙酸二乙酯的¹H-NMR图谱： 22

3.1.4化合物3 2,2'-（（4-甲酰基-3-羟基苯基）二烷基）二乙酸的¹H-NMR图谱： 23

3.1.5化合物4 （E）-2,2'-（（4-（（3'，6'-双（二乙基氨基）-3-氧代螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨] -2-基）亚氨基）甲基）-3-羟基苯基）二烷基）二乙酸 的¹H-NMR图谱： 24

3.1.6化合物1b的¹H-NMR图谱： 25

3.2 目标产物碳核磁谱图（¹³C-NMR）表征 26

3.2.1化合物1a罗丹明B酰肼的¹³C-NMR表征 26

3.2.2化合物1 2,2'-（（3-羟基己二烯基）二烷基）二乙酸二乙酯 ¹³C-NMR图谱： 27

3.2.3化合物2 2,2'-（（4-甲酰基-3-羟基苯基）二烷基）二乙酸二乙酯的¹³C-NMR 图谱： 28

3.2.4化合物3 2,2'-（（4-甲酰基-3-羟基苯基）二烷基）二乙酸 的¹³C-NMR图谱： 29

3.2.5化合物4（E）-2,2'-（（4-（（3'，6'-双（二乙基氨基）-3-氧代螺[异二氢吲哚-1,9'-呫吨] -2-基）亚氨基）甲基）-3-羟基苯基）二烷基）二乙酸 ¹³C-NMR图谱： 30

第四章 结论与展望 31

4.1结论 31

4.2展望 31

参考文献 32

致 谢 36

第一章 文献综述

1.1引言

研究表明一氧化氮(NO)起着生物信号传导剂的作用，确立了内源性产生的气态小分子作为许多生理过程的调节剂的重要性^[1-3]。广泛认为，以NO为媒介的信号传导起着控制血压和流量的作用。免疫反应和神经传递以及NO在血压控制中的作用解释了临床上长期使用的药物如硝酸甘油的作用机制^[2,4-6]。这些初步结果引发了广泛的调研，以验证和研究以NO为媒介的生理信号^[4,7,8]。例如，在平滑肌松弛方面，金属-血红素蛋白，特别是可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）经鉴定为NO的有效生物靶标，最终成功开发出调节NO作用的新型临床磷酸二酯酶抑制剂^[4,5]。蛋白质硫醇与NO或其氧化还原形式反应，产生控制NO运输、保存以及构成基于NO转移后修饰的S-硝基硫醇（RSNO）^[13,14]。

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