论文总字数：26722字

摘 要

脂肪酶是一种水解长链脂肪酸甘油酯的酶，作为生物催化剂，一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。脂肪酶酶活分析技术在众多领域中是不可缺少的关键技术，因此发展一种可靠的、简单的和灵敏度高的检测脂肪酶活的方法是十分迫切的。

本论文中，吐温既作为脂肪酶的底物，又作为原位合成纳米金的还原剂，构建了一种新型的基于酶原位调节生长的纳米金比色法检测脂肪酶活的传感器。其测定脂肪酶酶活的原理是利用脂肪酶酶活性的大小控制原位形成的纳米金的成核速率，进而控制最终合成好的纳米金颗粒的尺寸、颜色与谱图，从而达到检测脂肪酶活的目标。此方法实现了传感器的组装与目标物的检测同时进行的效果，真正意义上简化了纳米金多步修饰的过程，因此具有很大的应用前景。

关键词：原位合成 脂肪酶 纳米金比色法

ABSTRACT

Lipase is a long-chain fatty acid ester hydrolysis enzyme, as biocatalysts, lipases biotechnology sector has always been the most important class of enzymes. Lipase activity analysis techniques in many fields are indispensable key technology, the development of a reliable, simple and highly sensitive method for the detection of lipase activity and it is very urgent.

In this thesis, Tween as a lipase substrate, and as a reductant in situ synthesis of gold nanoparticles to build a new pro-level adjustment based on the growth of nano-gold colorimetric detection of lipase activity sensor. The measurement principle of lipase is the use of lipase activity control the size of gold nanoparticles formed in situ nucleation rate and thus control the size, color and trace the ultimate synthesis of gold nanoparticles, so as to achieve the detection of lipase live. This method achieves the effect of assembly and object detection sensors simultaneously, simplifying the multi-step modification of nano-gold in the true sense of the process, so it has great prospects.

Keywords: Situ synthesis Lipase AuNPs-based colorimetric assay

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 脂肪酶的概述 1

1.1.1 脂肪酶的简介 1

1.1.2 脂肪酶的来源与应用 2

1.1.3 脂肪酶酶活检测现状 2

1.2 吐温的概述 3

1.2.1 吐温简介 3

1.2.2 吐温80 4

1.3 原位合成的纳米金比色法在酶活检测中的应用 5

1.4 基于原位合成的纳米金比色法检测脂肪酶酶活 6

第二章 实验部分 8

2.1 实验仪器和试剂 8

2.1.1 实验仪器 8

2.1.2 实验药品 9

2.2 实验试剂与缓冲液的配制 9

2.3 脂肪酶酶活检测 10

2.3.1 传感机理验证 10

2.3.2 吐温类型的确定 10

2.3.3 吐温80浓度的确定 10

2.3.4 氯金酸浓度的确定 11

2.3.5 最适pH的测定 11

2.3.6 最适温度的测定 11

2.3.7 反应时间的测定 11

2.3.8 酶活动力学的测定 12

2.3.9 脂肪酶的定量 12

2.3.10 实际样品的检测 12

第三章 结果与讨论 14

3.1 传感机理的验证 14

3.2 吐温类型的影响 17

3.3 吐温80浓度的影响 18

3.4 氯金酸浓度的影响 19

3.5 pH的影响 20

3.6 温度的影响 21

3.7 反应时间的影响 22

3.8 脂肪酶的定量 23

3.9 酶活动力学的测定 26

3.10 实际样品的检测 27

第四章 结论 30

4.1 结论 30

参考文献 31

致 谢 35

第一章 绪论

1.1 脂肪酶的概述

1.1.1 脂肪酶的简介

脂肪酶(三酰甘油酯水解酶，Lipase)是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，如图1.1所示^[1]。使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。

在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。当酶接触双向油水界面时，Ser-残基被“α-螺旋盖”掩蔽起来，与分子表面被一界面所隔开，形成由暴露憎水基包围的、由亲水基组成的脂肪酶亲电区，这种结构有利于催化过程中底物对活性中心亲和力的提高以及活性中间体的稳定。因此，界面激活现象通常与“α-螺旋盖”的重新定向排列（构象改变）有关^[3]。

在反应过程中，Ser、Asp、His通过与底物形成四面体中间复合物完成催化过程。在正常情况下，丝氨酸蛋白酶直接暴露在表面，而脂肪酶活性中心隐藏在V型结构中，表面被相对疏水氨基酸残基形成α-螺旋结构覆盖，对三联体起保护作用。当脂肪酶与界面接触时，此盖打开，通过亲电子域的创造导致脂肪酶构象改变，从而使活性中心暴露，从而与底物结合并催化反应^[4,5]。Rrzozowski等人通过对R.miehei脂肪酶的研究证明，其活性部位是通过环的旋转在W/O表面暴露出来，此时增加了活性部位的非极性表面积，就能够结合到底物。在蛋白质结构被包埋的活性部位的深度说明了许多脂肪酶对长链的脂肪酰基酯的特异性^[6]。

TAG代表甘油三酯 DAG代表甘油二酯 MAG代表单酰基甘油

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