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一种温和标记方法在聚糖结构分析中的应用

摘要

研究表明，O-(4-硝基苄基)-羟胺可通过还原氧胺化反应对模型糖链进行标记，反应条件温和，能替代常用的还原胺化法。在上述反应中，先等量生成肟式产物，但接下来的还原反应并不完全。因此，在本研究中，我们合成了新型标记物：O-和N-取代的7-羟基香豆素和3-甲氧苯基羟胺香豆素。它们均可在非常温和的水相环境下分别与模型聚糖进行等量肟化与还原羟胺化反应，所得荧光衍生化产物具有良好的色谱、质谱属性。最后，我们采用两种荧光衍生化方法分别成功地标记了聚糖和糖胺聚糖（肝素和硫酸乙酰肝素）的寡糖片段。

1.引言

糖结构具有极大的多样性，复杂糖化合物的结构解析对于分析化学家来说仍是一个极富挑战性的课题。在具有生物活性的结合-识别系统中，含特殊结构序列的化合物浓度极低，通常只有皮摩尔数量级，这大大限制了其研究。因此，为了鉴定糖链序列结构，通产需要将糖链从其他组分中有效地分离出来，然后再进行高灵敏度检测。此外，由于糖链本身的亲水性与缺乏合适的生色团，导致不能用常规分离技术（如反相高效液相色谱法）对它们进行分离。而且常规检测器，如示差折光器和脉冲安培检测器，虽然可用于天然糖的检测，但是对于多种生物环境中低浓度的聚糖来说，它们的检测灵敏度依然不足。

糖胺聚糖（GAGs），如肝素和硫酸乙酰肝素（HS），在许多生命进程中起着至关重要的作用。HS是一种复杂的硫酸多糖，它由高达400的改性糖链单位构成。HS存在于大多数多细胞动物中，尤其在细胞表面和大多数组织的细胞外基质中有着广泛表达。HS是一种蛋白聚糖，由糖胺聚糖和核心蛋白两部分构成。HS的核心蛋白结构研究，如在肽段序列和克隆方面，已取得了长足的进展。但其聚糖结构方面的研究还非常有限。因为，尽管HS最初是生物合成出来的一种二糖单位（葡萄糖醛酸—N-乙酰葡萄糖胺的）的简单重复，但随后进行的修饰，如N-脱乙酰化，N-复硫酸盐化，D-葡糖醛酸残基C-5上差向异构化转为L-艾杜糖醛酸以及多种残基的O-硫酸化，等，都促成了其极为多样的结构。HS分子一般包括高度硫酸化的短结构（4-16残基）和非硫酸化的相关长结构。肝素仅存在于肥大细胞颗粒中，是HS最大程度硫酸化和异构化的一种特殊形式。

质谱法因其灵敏度高、能产生具有结构信息的碎片离子等特点，已成为GAG片段表征的主要方法。由于GAG存在大量硫酸基团，其质谱分析往往采取负离子模式。但当GAG与游离酸或铵盐一块进行质谱分析时，会发生大量气相脱硫酸基，这会降低其整体检测灵敏度，且有可能抑制具有结构信息的碎片离子的生成。虽然GAG钠盐离子相对更为稳定，但是钠盐离子易形成团簇，这会影响其质谱图中分子质量的鉴定。

在肝素片段的质谱检测中，我们通常使其与富精氨酸肽或蛋白形成复合物后，采用正离子模式进行基质辅助激光解吸电离-时间飞行质谱（MALDI-TOF）分析。肽/GAG片段复合物的形成可以提高分析灵敏度，排除无机阳离子的干扰，并减少低分子量寡糖的脱硫酸基。然而，硫酸基团数目越多脱硫酸基程度越高。通过分子量的测定能确定单糖单元数、N-乙酰基团和硫酸基团数，但不能提供进一步的结构信息，如硫酸基的位置。

对于亚硝酸或酶法解离的GAG片段，通常可采用凝胶渗透色谱法（GPC）、强阴离子交换色谱法（SAX）、离子对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC）、聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）和毛细管电泳法（CE）进行分离。这些技术大多需要利用缓冲溶液和/或者盐溶液来实现最佳分离。GAGs本身的阴离子特性使其对Na 、K 、Ca² 和其他阳离子具有高亲和力，从而较难得到纯度高、无盐的产物，样品不易长期保存。同时，这些反离子还能与GAG离子按不同比例加合，产生不同质荷比的分子离子，使得GAG寡糖的质谱分析受到影响。为将这些阳离子脱盐或替换掉，可对较大GAG片段进行渗析,或者用另一种盐（如NH₄HCO₃）来交换，这种铵盐易挥发，在真空中容易去除。

现有许多方法通过在聚糖还原端引入相应基团以实现聚糖的选择性标记。这些基团可以提高检测灵敏度，多数还能能够促进色谱分离。HASE最近发表的一篇综述对该课题进行了阐述。还原胺化是在糖的还原端引入标记基团的最常用方法。该反应温度高、pH值低、反应时间长，且需要在还原剂存在的条件下，与大量过量芳胺试剂反应。这种剧烈的反应条件能导致热敏感的糖的降解以及GAG片段的脱硫酸基反应。而且该反应由于在相同pH条件下，糖本身会发生竞争性的直接还原反应，这会导致产物产率变化较大。糖还原胺化使用的优良试剂是2-氨基吡啶，该试剂常用于糖蛋白中唾液酸化N-连接聚糖的HPLC定量分析。采用改进后的两步法，虽然解决了衍生化和还原反应之间的竞争问题，但仍需要在高温下生成席夫碱（90 ℃，60 min）并进行还原（80 ℃，50 min），因此不适用于硫酸化糖的标记。

因此，人们开始转而寻求一种能在温和条件下对糖还原端进行选择性衍生化的方法。我们认为，能对GAG片段或其他一系列糖类物进行标记的试剂应符合以下要求：（1）能在温和条件下，定量地、选择性地链接到糖的还原端并形成稳定的衍生产物；（2）在水相环境中具有荧光活性；（3）有适当的疏水性，利于反相HPLC的分离；（4）分子量低，从而衍生后寡糖的色谱行为主要是由糖而不是标记部分来决定；（5）能引入提高质子化效率的位点，以提高正离子模式下的质谱检测灵敏度。

经研究，O-取代羟胺类化合物与糖进行的还原羟胺化反应可能符合上述要求。因此，我们用商品化试剂O-(4-硝基苄基)-羟胺（NBHA）与新合成的具有荧光活性的O-取代甲氧苄基和7-羟基香豆素作为衍生试剂，研究了它们与模型聚糖的反应，并优化了反应条件。我们还合成了N-取代羟胺化合物衍生试剂，研究表明，它们可以在极其温和的条件下与糖类反应，生成N,N-二取代羟胺类化合物。

2.结果与讨论

我们合成了几种N-和O-取代羟胺标记物（1-4），它们同NBHA的光谱性质如表1所示。我们用模型单糖，如葡萄糖（Glc）和N-乙酰葡萄糖（GlcNAc），与之反应，并探索其反应条件。因为亚硝酸降解肝素和硫酸肝素，会在糖链还原端得到2,5-脱水-D-甘露糖（5,2,5-an-man）和2,5-脱水-6-O-磺基-d-甘露糖（6,2,5-An-Man6SO₃）残基。因此，可将这两种单糖作为模型糖，来研究亚硝酸解离的肝素和硫酸肝素片段的标记。

目前肟化方法有：还原糖与吡啶和O-取代羟胺混合加热；氢氧化钠水溶液中加入乙醛和过量的羟胺。但上述两种方法均不适用与GAG的标记，因为碱性条件将导致N-磺基葡（萄）糖胺的C-2差向异构而且会导致“脱皮”，即还原端残基的逐步水解，其次反应液中的吡啶难以除去。所以，我们选择反应条件为弱酸性水相环境。

Darvill等人之前利用NBHA作为糖还原端标记物，改善了中性与酸性糖的色谱分离，同时还引入了合适的紫外生色团。本研究中，我们不使用吡啶，在只用水作为溶剂的条件下，研究了NBHA与Glc和GlcNAc的反应，简化了Darvill等人过于繁琐的实验步骤。我们用反相高效液相色谱-二极管阵列检监控了pH值在3-6范围内，肟式产物的形成。结果表明，在pH=4时，反应生成等量的肟。因此，在以后的肟化反应中，我们均使用这一pH值。HPLC分析同时也检测了到多种衍生产物的生成（如图1所示）。经HPLC分离，可有效将衍生产物除盐，分离收集到的组分可用于电喷雾质谱（ESIMS）检测。检测结果表明，所有衍生产物都具有相同的分子质量，这说明它们互为同分异构体，即E-和Z-无环肟和alpha;-和beta;-环形产物（如方案1所示）。将其中任意一个峰分离出来，再次进行HPLC分析，产生的色谱图与最初混合物的色谱图相似，这说明产物之间是可以相互转化的。HPLC分析还表明，在室温，pH=4的情况下，分别在130 min和350 min后得到等量衍生产物Glc-NBHA和GlcNAc-NBHA。在70 ℃，pH=4的条件下，标记物与Glc和GlcNAc分别在30 min和80 min反应完全。与之相比，在室温，pH=4的条件下，NBHA与2,5-An-Man （5） 和 2,5-An-Man6SO₃（6） 的裸露醛基的反应在20min内即可完成。

由于HPLC谱图上出现的多个Glc和GlcNAc衍生产物峰会复杂化糖结构的分析，并降低整体灵敏度。而且对Glc-肟衍生产物的检测表明，HPLC收集的纯肟式产物会在0 ℃以下，0.1%浓度的TFA溶液中，以每天2%的速率发生水解。因此，有必要将肟衍生产物还原成一种单一稳定的N,O-二取代羟胺化合物，已达到改善色谱分析，提高检测灵敏度和长时间保存的目的。还原后成的仲胺基团亦可为正离子模式下ESIMS分析提供质子化位点，增强离子化效率。 本研究中，我们选择氰基硼氢化钠（NaCNBH₃），一种“温和”的还原剂，进行还原反应。该物质具有pH依赖性，从而具有一定的反应选择性。在pH=4的条件下，糖与过量的NBHA反应生成肟，再将pH值调整为3，然后在加入2当量的NaCNBH₃。用HPLC对该反应进监测，结果表明肟化合物：Glc-NBHA和GlcNAc-NBHA均还原为一种N,O-取代的羟胺主产物（图1（b）方案 2）。尽管还原反应较慢（Glc-NBHA在室温下反应5 h，GlcNAc-NBHA在室温下反应20 h），但产率稳定，将始终＞90%。但是该还原反应不是等量反应，因为可观察到未被还原的肟（图1（b））。还原产物在-20 ℃下，可保存数个月。还原反应较慢的原因可归咎于环状不可还原肟与非环肟之间的相互转化（方案 1）。这一推论通过我们观察到的现象，即非环肟2,5-An-Man-NBHA的还原迅速且为等量反应，得到了印证。但是，肟2,5-An-Man6SO₃-NBHA不能被完全还原，这可能是由于受到了硫酸基团的影响。

想要对子皮摩尔级的化合物进行色谱检测，需要用到荧光试剂。因为NBHA的紫外生色团不具荧光性且为非商品化试剂，所以有必要合成一些低分子量的荧光试剂。我们合成了两种O-取代羟胺荧光标记试剂：O-(4-甲氧苄基)-羟胺（1）和8-氨氧甲基-7-羟基香豆素（2），并用其与四种模型糖（Glc，GlcNAc，5和6）进行反应。反应条件与NBHA衍生化条件相同。与NBHA一样，HPLC分析表明1和2的反应形成了多种异构肟产物。在温和反应条件下（pH=4，rt），肟的生成是等量反应。肟还原后生成一种稳定且具有荧光活性的N,O-双取代羟胺产物，同时还有一些数量不定的未还原肟，这和NBHA肟产物类似。本实验中，肟及其还原产物通过ESIMS进行了确定。

我们合成N-取代羟胺作为糖标记试剂的动机起源于还原氧胺化反应中，HPLC检测到的一个异常峰。我们在NaCNBH₃还原 GlcNAc和NBHA的羟胺化产物的反应动力学研究中，观察到在一定的反应条件下（pH＞4，rt，10:1 GlcNAc-NBHA），HPLC检测到一个新产物峰，该峰保留时间靠前。通过ESIMS-MS分析，该组分为NBHA-二糖还原衍生产物，其质子化离子MH 的质荷比为579。我们推断，该物质是季铵离子中间体在没有酸的条件下，由NaCNBH₃还原形成。这个出人意料的结果使得我们做出以下假设：由N-取代羟胺和糖类的醛基所形成的硝酮产物（N上带有一个正电荷），可以在接近中性的pH条件下被NaCNBH₃还原成对应的 N,N-双取代羟胺。

于是，我们合成了两种荧光N-取代羟胺试剂：N-(3-甲氧苄基) -羟胺（3）和7-羟基-8-羟胺甲基香豆素（4），方法大致为：先用羟胺与相应的芳醛进行缩合生成肟，然后在pH=3的条件下，用NaCNBH₃快速还原。我们随后在pH=6.5，室温，NaCNBH₃存在下，一锅法用四种模型聚糖（Glc，GlcNAc，5和6）与3和4反应，生成相应数量相同的N,N-双取代羟胺。反应需在pH=6.5的条件下进行，因为pHgt;7时，N,N-双取代羟胺会自发氧化。而当pHlt;6时，可能会发生醛糖的竞争性直接还原。据HPLC所示，在无过量NaCNBH₃存在下，Glc和GlcNAc反应中的硝酮中间体在pH=6.5的水溶液中平衡浓度分别高达17%和12%。此外，硝酮产物还能从水溶液中被分离出来进行ESIMS检测。一般来说，硝酮在强烈还原剂如钯-H或氢化铝锂作用下，才可被还原成相应的取代胺。但结果表明，由于硝酮易极化，所以也可被弱还原剂NaCNBH₃还原。与那些肟衍生物类似，硝酮衍生中间体也可能存在几种的异构形式，如非环形E-和Z-硝酮（所有标准多聚糖），alpha;-和beta;-吡喃糖和alpha;-和beta;-呋喃糖型（只对Glc和GlcNAC而言）。环形硝酮中间体不易被还原，除非环型与环型异构体间转变非常迅速，否则它们的形成会阻碍硝酮的还原。Glc-硝酮中间体可以等量快速还原，因此可以推测它是非环的。相比之下，即使采用一锅法，GlcNAc-硝酮的还原过程依旧缓慢，这是因为它主要存在一个或者多个环状构型。为进一步证明，我们一锅法进行了2,5-An-Man（5）和2,5-An-ManSO₃（6）的还原羟胺化反应（pH=6.5，rt）。因为2,5-An-Man的醛基无法形成环，所以二者均可在30min内反应完全（方案 3）。

为研究N取代标记产物的色谱和质谱特性，我们将葡聚糖水解产物和玉米糖浆都用4进行标记，还原羟胺化法处理后用反相HPLC进行分析。葡萄聚糖水解液的色谱图上可观察到逐个的葡萄糖聚合物产物峰Glc_1-14，它们相邻分子间质量差为162。与传统的离子交换色谱法相比，反相HPLC法的明显的优势在于

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