通过改造7β-羟基类固醇脱氢酶辅酶的依赖性高效生产熊去氧胆酸外文翻译资料
2023-01-05 14:15:06
通过改造7beta;-羟基类固醇脱氢酶辅酶的依赖性高效生产熊去氧胆酸
原文作者 Zhi-Neng You, Qi Chen,Shou-Cheng Shi,Ming-Min Zheng, Jiang Pan, Xiao-Long Qian,Chun-Xiu Li and Jian-He Xu
单 位 华东理工大学
摘 要:脱氢酶广泛用作生物催化剂,用于在温和条件下生产光学纯化学品。大多数脱氢酶是烟酰胺辅酶(NADPH或NADH)依赖性氧化还原酶。7beta;-羟基类固醇脱氢酶(7beta;-HSDH)是熊去氧胆酸(UDCA)生化合成的关键酶。迄今为止,所有报道的7beta;-HSDH都是严格的NADPH依赖酶。然而,与NADPH相比,NADH更经济,使其成为脱氢酶合成应用的优先辅酶。在这项工作中,使用一种称为辅酶特异性逆转:小巧智能图书馆设计(CSR-SaSLiD)的策略,合理设计源自Ruminococcus torques的重组7beta;-HSDH以改变其辅酶依赖性,该策略基于结构信息和保守的序列比对。我们理性地设计了一个小巧智能的图书馆,仅包含五个突变体,可以快速识别目标变体。与野生型相比,所得突变体G39D显示从NADPH到NADH的辅酶特异性转换953,000倍,另一种突变体G39D / T17A导致NADH活性增强223倍。借助分子动力学模拟阐明了突变对辅酶偏好逆转和催化活性改善的影响的结构机制。此外,证实CSR-SaSLiD策略可以扩展到其他7beta;-HSDH。该工作提供了改变辅酶偏好并随后恢复酶活性的有效方法脱氢酶用于具有成本效益的生物技术应用。
关键词:生物催化,辅酶依赖,小巧智能库,7beta;-羟基类固醇脱氢酶,分子动力学模拟,熊去氧胆酸
一、前言
脱氢酶是一类以高效,精确选择性和环境友好的方式催化各种化学反应的酶。这些酶是有前途的生物催化剂,可以用于制备手性醇,氨基酸,生物燃料,聚合物和药物以及污染物降解。脱氢酶需要辅酶来执行它们的催化功能,最常见的是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD )或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP )。由于辅酶的化学计量用量昂贵,因此已经为其技术应用建立了几个涉及NAD(P)H再生系统的生物还原过程。最常见的方法涉及添加牺牲共基底和另一种辅助酶,如甲酸脱氢酶(FDH),葡萄糖脱氢酶(GDH)或亚磷酸盐脱氢酶(PDH)。虽然已广泛研究了原位辅酶再生,但是为了实现有效的辅酶再生,仍然需要催化量的NAD(P) (约0.1-0.5 mM)。同时,只有少数酶可以使用全细胞的细胞内辅酶(通常浓度低至lt;0.01 mM)来实现辅酶回收。因此,为了减少与外部补充的辅酶相关的主要经济成本,其中一种有效的方法是将脱氢酶的辅酶从NADP(H)转换为NAD(H),这在工业条件下比NADP(H)成本低得多且更稳定。自Scrutton等人以来,辅酶依赖性的开关已经成为一个受欢迎的研究领域。首先报道1990年的辅酶特异性工程,特别是代谢工程或工业生物催化中的酶应用。转化辅酶依赖的主要方法有三种:合理设计,半合理设计和随机诱变。这些方法已用于逆转各种酶的辅酶依赖性,包括脱氢酶,9种酮还原酶,10种酮酸还原异构酶,8种亚胺还原酶,11种NADPH氧化还原酶,12种NAD(P)H氧化酶,13种细胞色素450还原酶,14种和Baeyer-Villiger单加氧酶。然而,在大多数情况下,辅酶依赖性逆转往往导致催化活性急剧下降。最近,Arnold等人发展了用户友好的在线工具,辅酶特异性逆转-结构分析和图书馆设计(CSR-SALAD),旨在促进转换辅酶偏好并随后恢复降低的催化效率。这个功能强大的工具已成功应用于辅酶特异性ACS Paragon Plus环境ACS催化逆转和乙醛酸还原酶的活性回收,肉桂醇脱氢酶,木糖还原酶,含铁乙醇脱氢酶和亚胺还原酶。然而,从包含数千个候选克隆的CSR SALAD文库中鉴定所需的突变体仍然是耗时且劳动密集的。
在我们以前的工作中,从Ruminococcus torques ATCC 35915(Rt7beta;-HSDH,NCBI登录号WP_015528793.1)鉴定的新的NADPH依赖性7beta;-羟基类固醇脱氢酶(7beta;-HSDH; EC 1.1.1.201)被表征和应用。使用级联反应酶促生产熊去氧胆酸(UDCA)。18UDCA是一种有效的药物成分,用于溶解胆固醇胆结石和改善胆汁淤积性疾病的肝功能。然而,辅酶(NADP )的高成本使其实际应用变得困难。 在这项工作中,我们的目的是将Rt7beta;-HSDH的辅酶依赖性从NADPH转换为NADH,以便经济有效地生产UDCA。因此我们采用了这样的改进的策略,以下称为辅酶特异性逆转:小型和智能图书馆设计(CSR-SaSLiD)被提议改变脱氢酶的辅酶依赖性并增强催化活性。建议的CSR-SaSLiD策略涉及三个步骤:首先,从结构上分析NADPH和NADH依赖性酶的磷酸酯或羟基结合口袋,并进行保守序列比对。其次,确定位于关键辅酶结合环上的关键残基,并设计一个小而智能的关键残基库,鉴定其可能影响酶的辅酶依赖性。最后,基于序列和结构信息鉴定保守辅酶结合基序中的潜在热点,并设计定点突变体以恢复催化活性。
根据上述CSR-SaSLiD策略,选择的热点要少得多,使得设计的库比CSR-SALAD设计的库小得多。我们设计了一个CSR-SaSLiD库,它只包含五个变体导致成功发现两种所需的Rt7beta;-HSDH突变体:G39D,提供NADH / NADPH辅酶特异性的953,000倍逆转,和G39D / T17A,对NADH的活性增强223倍。据我们所知,这是第一个通过合理设计获得的NADH依赖性7beta;-HSDH。使用CSR-SALAD网络工具时,预测了14个热点,产生超过一千个突变体的文库用于筛选(图S1),并且在筛选后未获得所需的变体。此外,通过分子动力学模拟阐明了辅酶偏好逆转和催化活性改善的机制。CSR-SaSLiD方法的一般适用性也在另外两种7beta;-HSDH中得到验证。由于所有报道的基因序列的天然7beta;-HSDHs都是严格依赖NADPH的,到目前为止还没有报道可以使用NADH作为辅酶的7beta;-HSDH,工作提供了一种合理的蛋白质工程策略,以准确地改变辅酶依赖性并快速恢复活性,从而能够创造具有工业潜力的新型7beta;-HSDH。作为CSR-SALAD的补充和改进,CSR SaSLiD战略是被认为有助于在工业中实现更具成本效益的基于脱氢酶的生物转化。
图1 CSR-SaSLiD策略的三个步骤:(1)酶结构分析和常规序列对比; (2)设计小型智能图书馆; (3)鉴定保守的辅酶结合基序中的热点以恢复活性
二、结果和讨论
(一)通过CSR-SaSLiD策略转换Rt7beta;-HSDH的辅酶依赖性
源自Ruminococcus torques ATCC35915(Rt7beta;-HSDH)的NADPH依赖性7beta;-HSDH属于短链脱氢酶/还原酶(SDR)家族。酶属于SDR家族通常遵循顺序有序的动力学机制,其中辅酶(NADH/NADPH)首先与酶结合,然后结合底物,导致产物和副产物的形成和随后的释放(NAD /NADP )。SDR酶的活性位点包含高度保守的序列Asn-Ser-Tyr-Lys(Asn115,Ser143,Tyr156和Rt7beta;-HSDH中的Lys160),其被鉴定为催化四分体。Ser残基通过稳定和极化底物中的羰基而在底物识别中起重要作用。Tyr残基与底物形成氢键并在还原反应中充当催化碱。赖斯是至关重要的通过静电相互作用使辅酶正确定向并降低Tyr的pKa。Asn将水分子稳定在Lys的氢键距离内,形成将大量溶剂连接到Tyr残基的质子中继系统。辅酶NAD(P)H提供氢化物离子,其从烟酰胺环的C4转移至基板。
在SDR家族中,酶的beta;2alpha;3环(图2A)是具有NADPH或NADH的辅酶结合结构域之一。由于辅酶NADPH和NADH之间的唯一结构差异在于腺苷部分,在NADPH中具有2-磷酸基团并且在NADH中具有羟基,位于beta;2alpha;3环上的残基将直接决定酶辅酶依赖性一般 ,NADPH依赖性酶具有较大的磷酸结合口袋,带正电荷的残基与带负电荷的相互作用2-磷酸基团。然而,NADH依赖性酶更喜欢带负电的残基,由于静电排斥而使NADPH远离6b,此处,Rt7beta;-HSDH和其最接近的17个具有确定晶体的同源物选择结构用于多序列比对。如图2A所示,在beta;2alpha;3环的N-末端的不带电荷的小氨基酸(Ala或Gly)在NADPH依赖性酶(例如Rt7beta;-HSDH中的G39)中是特异性保守的。相反,NADH依赖性酶中的这一位置被保守和带负电荷的Asp残基取代(D39,突出显示于橙子)。该Asp残基可与NADH中腺苷核糖的2-和3-羟基形成氢键(图2B),这有利于NADH与酶的紧密结合。因此,我们最初设计突变G39D作为切换Rt7beta;-HSDH辅因依性的候选变体。
图2 辅酶结合位点的序列和结构分析:(A)Rt7beta;-HSDH的辅酶结合基序及其与SDR家族的17个最密切相关的结构的多序列比对的摘录。根据辅酶特异性(NADH或NADPH)对同源物进行分级。T(L)GXXXGXG基序和beta;2alpha;3环呈黑色框。 完整的序列比对在支持信息中可见。(B)具有NADPH(左,绿色),具有NADH(中间,青色)的G39D和具有NADH的G39D/T17A(右,青色)的野生型酶的结构模型。引入的突变(Gly39Asp和Thr17Ala)显示有品红标记。
另一方面,NADPH依赖性酶的beta;2alpha;3环上的带正电荷的Arg残基(R40,图2A;蓝色突出显示)也很保守,因为它不仅形成与2-磷酸基团的静电相互作用。 NADPH(磷酸)腺苷核糖,也与辅酶的腺嘌呤部分的pi;-阳离子相互作用(图2B)。同时,虽然Rt7beta;-HSDH中的Arg41在NADPH依赖性酶中不是很保守,但它也可以与NADPH的2-磷酸基团形成有利的静电相互作用。由于NADH依赖性酶更喜欢带负电荷的残基,我们引入了另外两种可能有利的突变,即R40D和R41D,它们会根据计算机分析改变辅酶依赖性。基于以上理性分析,我们确定了三个野生型Rt7beta;-HSDH的beta;2alpha;3环上的关键磷酸盐配位残基,即G39,R40和R41(图2A),可以确定辅酶依赖性,然后设计一个包含三个突变的小型智能库G39D, R40D和R41D,用于将Rt7beta;-HSDH辅酶从NADPH转换为NADH。
根据催化活性测定结果,如表1所示,G39D使辅酶NADH的比活性增加了25.4倍(从0.024到0.61 U/mg -1),而变异G39D与NADPH的比活性显着降低。 8.09至0.0029 U mg-1。然而,其他两个变种,R40D和R41D,显示对NADH没有可衡量的活动。值得注意的是,从NADPH到NADH的辅酶特异性的完全逆转仅通过单点突变G39D实现。关于酶动力学(表2),变体G39D对NADH的特异性常数(kcat/KM)从0.15增加到4.57 mM -1 s -1,而与野生型酶相比,对NADPH的影响显着减少了27,900倍,从558减少到0.02 mM -1 s -1。因此,G39D的单点突变导致辅酶特异性的真正戏剧性转换高达953,000倍,从而将NADH/NADPH特异性的比例从0.0003提高到286。
表1 Rt7beta;-HSDH及其7-Oxo-LCA的突变体使用NADH或NADPH的活性
图3 WT中NADPH(左)和NADH(右)的结合模式分析
(二)回收辅助因子切换酶的催化活性
与野生型酶对其天然辅助因子NADPH的催化活性相比,辅因子依赖性的转换通常伴随着对所需辅因子NADH的催化活性的显着降低。G39D与NADH的转换数(kcat)为0.425 s-1,比野生型Rt7beta;-HSDH与天然NADPH(4.46 s-1)(表2)低10倍。因此,补偿性突变需要引入以恢复辅因子转换变体的催化活性。根据CSR-SaSLiD策略,基于序列和保守的辅因子结合基序中鉴定了一些潜在的热点和结构信息。
对G39D的多序列比对和3D结构的详细分析,保守序列T(L)GXXXGXG基序中的极性Thr或Ser残基(Rt7beta;-HSDH中的T17,图2A;以绿色突出显示)是保守的。NADH依赖性酶中的疏水性和小氨基酸(Ala或Gly)(图2A;以黄色突出显示)。我们假设一边Thr17链可能与NADH腺苷核糖的3-羟基形成氢键(图2B),这可能妨碍NADH与酶的最佳结合。因此,17位的苏氨酸作为恢复辅因子转换酶的催化活性的靶。因此,进行了两个定点突变:G39D/T17G和G39D/T17A来进行实验验证。如表1所示,双突变体G39D / T17A的比活性增加了8.8倍,从0.61 U/mg -1增加到5.35 U/mg -1,而其底物7-oxo-LCA的KM略微增加到0.051 mM与起始单突变体G39D(0.040 mM)相比。从确定每种辅酶的两种双突变体的动力学角度来看(表2),NADH的KM值与G39D/T17G(0.140 mM)和G39D/T17A(0.108 mM)与G39D相似(0.093 mM)。然而,与单突变体G39D(0.425 s-1)相比,在较低成本的
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