来自Leifsonia醇脱氢酶（LSADH）不对称催化形成(R)-构型的手性醇

Kousuke Inoue, Yoshihide Makino, Tohru Dairi, Nobuya Itoh

摘要：编码Leifsonia醇脱氢酶（LSADH）的基因是一种用于生产(R)-手性醇的生物催化剂，从Leifsonia sp.S749的基因组DNA中克隆。该基因含由对应于251个氨基酸残基的756个核苷酸组成。计算出亚基分子量为24,999，这与通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的一致。 该酶在重组大肠杆菌细胞中表达，并通过三个柱色谱纯化。假定的氨基酸序列与已知的短链醇脱氢酶/还原酶（SDR）显示出30-50%的同源性。此外，NADH结合位点和SDR中的三个催化残基是高度相似。过量表达LSADH的重组大肠杆菌细胞使用2-丙醇作为氢供体从酮中产生(R)-形式的手性醇，具有迄今报道的最高生产力水平和对映体过量（e.e.）。

关键词：乙醇脱氢酶； Leifsonia sp；不对称生物还原;生物催化剂；(R)-手性醇

一、前言

近年来，使用生物催化剂生产了多种手性化合物，包括D-和L-氨基酸，有机酸，胺，醇，环氧化物等，因为这些方法在对映选择性方面优于一般化学方法。其中，仲醇是药物和农用化学品中最重要的手性合成子。

Noyori等人已经开发出有效的转移氢化催化剂：BINAP和衍生物铼的配合物，氢，甲酸或2-丙醇也可以作为酮还原的氢供体。但是，在许多情况下，催化剂的成本、可操作性，以及获得足够的光学纯度和生产率等仍然存在困难。化学不对称还原过程的替代方案是使用酶或微生物的生物催化转化系统。

在20世纪80年代开发了用于拆分手性醇的酶促酰化，并且已经使用几种脂肪酶作为生物催化剂，但是在大多数情况下，对于酶促拆分，仅获得50%的所需中间体产率。

还描述了用还原酶和脱氢酶还原酮的许多实例，因为这样的方法理论上产生具有100%酮转化的醇。但是，在大多数情况下，，尽管它们显示出相当高的对映选择性，但它们具有窄的底物谱和低生产率的缺点。因为需要辅助因子再生系统，如NADH和NADPH，因此，只有当辅因子可以在第二催化循环中原位再生时，这种生物还原过程才是经济的，例如，甲酸/甲酸脱氢酶（FDH）或葡萄糖/葡萄糖脱氢酶（GDH）。最近关于生物对称还原的研究揭示了只有当一个强大的辅助因子再生系统与该过程结合时，才能获得大大提高的生产力。

从再生NAD（P）H的角度来看，异丙醇是另一种适合生物还原的氢供体，因为它具有化学性质和低成本。最近，Itoh等人报道了来自苯乙烯同化红球菌（原棒状杆菌）的苯乙醛还原酶（PAR）。

我们还在Leifsonia sp.S749中发现了一种新的ADH（LSADH）产生(R)-醇,并对其进行了详细的表征. LSADH是一种NAD 依赖性的ADH，它用酮类产生许多手性醇，beta;-酮和beta;-酮酯具有高对映选择性。该过程可在没有额外辅酶再生系统的情况下在异丙醇存在下以与PAR类似的方式起作用（图1）

在本报告中，我们描述了含有Leifsonia sp S749的LSADH的基因的大肠杆菌的克隆，序列分析和表达，以及重组酶的纯化。 我们还证实，已建立的表达系统可以很好地起作用，作为异丙醇的氢转移生物催化剂，以产生手性(R)-醇。

二、实验方法

Leifsonia sp. S749，棒状杆菌革兰氏阳性菌，用作染色体DNA的来源。E. coli XL1-Blue MRF0 ((mcrA)183 (mcrCBhsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F0 proAB laclqZDM15 Tn10 (Tetr)]) 用作构建质粒基因组文库的宿主菌株。E. coli JM109 (recA1endA1, gyrA96, thi,hsdR17(rK mKthorn;), e14 (mcrA), supE44, relA1, (lac-proAB)/F0[traD36, proABthorn;, lac Iq, lacZM15]),BL21(DE3) (F, ompT, hsdSB(rB mB), gal(cI 857,ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm(DE3)),and BL21 (F ompT hsdSB (rBmB) gal dcm) 用作LSADH表达的宿主菌株。使用黏粒pWE15（Toyobo，Osaka）作为构建基因组文库的载体。质粒pGEM-T easy载体（Promega，Madison，WI），pUC118和pGEM5Zf（Promega）用作克隆载体。质粒pET21b（Novagen / Merck Biosciences，San Diego，CA），pKK223-3和pTrc99A（Amersham Pharmacia Biotech，Tokyo）也用作表达载体。对于基因克隆和酶纯化，除非另有说明，否则在37 ℃下在含有0.1 mg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物和0.5%NaCl，pH 7.0）中培养大肠杆菌细胞。为了在lac启动子的控制下诱导基因，将0.4 mM异丙基D硫代半乳糖苷（IPTG）加入LB培养基中。为了选择含有插入DNA的pGEM-T easy或pUC118的重组细胞，将0.01%（w/v）5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷（X-Gal）加入到1.5%（w/v）LB琼脂。为了从Leifsonia sp 菌株S749中制备基因组DNA，将细菌在含有0.5%（w/v）蛋白胨和0.5%（w/v）酵母提取物（pH 7.0）的液体培养基中于30℃培养约18小时。

LSADH的部分NH2-末端和内部氨基酸序列。 将酶在SDS-PAGE凝胶上电泳，使用半干电印迹装置（NA-1512，Nippon Eido，Tokyo）以0.8mA / cm 2凝胶的恒定电流转移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜（Bio-Rad），用于 用Hirano和Watanabe的方法90分钟，然后用考马斯亮蓝G-250染色。使用HP G1005A蛋白质测序系统（Hewlett Packard，Palo Alto，CA）测定PVDF膜上酶的NH2-末端氨基酸序列，其内部氨基酸由APRO Life Science Institute（Tokushima，Japan）测定。

如Hopwood等人所述的一般的重组DNA技术。分离来自Leifsonia 菌株S749的基因组DNA用来自Qiagen（Chatsworth，CA）的试剂盒纯化质粒DNA。限制酶购自Takara Shuzo（日本京都），Toyobo Biochemicals（Osaka，Japan）和New England BioLabs（Herts，UK），并根据制造商的说明使用。 T4 DNA连接酶购自New England BioLabs。 DNA聚合酶（Takara Ex Taq和Takara LA Taq）购自Takara Shuzo。通过电穿孔用质粒DNA转化大肠杆菌在标准条件下用Gene Pulser电穿孔系统（Bio-Rad）进行。使用CDP-Star试剂盒（Amersham Biosciences，Tokyo，Japan）按照制造商的说明用AlkPhos直接标记和检测系统非放射性地进行DNA杂交。如Sambrook等所述进行其他一般DNA操作程序。所有引物均购自Espec Oligo Service（Ibaraki，Japan）。

用于菌落杂交的探针的制备。合成了两个简并寡核苷酸引物，用于基于前述17）的天然LSADH（AQYDVADRSAIVTGG）和胰蛋白酶处理的LSADH（IAVNNAGIGGEA）的NH2-末端氨基酸序列克隆LSADH基因：5-引物，5-CARTAYGAYGTIGCNGAHMG-3和3-引物，5-CCDATICCNGCRTTRTTNAC-3。对于A或G，R表示简并位置，对于T或C表示Y，对于A或C表示M，对于A，T或C表示H，对于所有碱基表示N，对于肌苷表示I. PCR扩增在20 ml的反应混合物中进行，所述反应混合物含有100 pmol的两种引物中的每一种，90 ng的Leifsonia sp菌株S749染色体DNA，0.25 mM的每种脱氧核苷酸和2.5单位的Takara Ex Taq。初始变性在94 ℃下5分钟。将扩增曲线（94 ℃30秒，55 ℃30秒，72 ℃30秒）重复30个循环。通过凝胶电泳分析约280bp的扩增片段，纯化，并克隆到pGEM-T easy载体中。用染料终止子循环测序试剂盒和ABI prism 377 DNA测序仪（ABI，Perkin Elmer，Chiba，Japan）分析其核苷酸序列。使用AlkPhos直接标记和检测系统用CDP-Star试剂盒用碱性磷酸酶标记该片段，并用作菌落杂交的探针。

克隆LSADH基因。Leifsonia sp. S749细胞制备的基因组DNA用Sau3AI部分消化。分离分子大小为约15-20 kb的片段并通过蔗糖密度梯度离心纯化。将片段插入经BamHI处理的pWE15中，用Gigapack III金包装提取物（Stratagene，La Jolla，CA）包装到噬菌体颗粒中，并用于转染大肠杆菌XL1-Blue MRF0细胞以构建基因组文库。通过与碱性磷酸酶标记的280 bp DNA片段的菌落杂交筛选文库。 根据制造商的说明进行菌落杂交。 使用FASTA程序进行基于同源性的搜索。

用于在大肠杆菌中表达LSADH的载体的构建。用于通过PCR扩增基因的引物列于表1中。如下构建六个重组质粒载体：引物ULAF和ULA-R用于从Leifsonia sp S749（pWELA6）的基因组DNA扩增0.8 kb LSADH片段，并将在琼脂糖凝胶上纯化的PCR片段插入到pUC118的BamHI-PstI位点给出pULA。以类似的方式，使用引物KLA-F和ULA-R扩增lsadh，并将纯化的片段插入载体pKK223-3的EcoRI-PstI位点以得到pKLA。纯化使用引物TLA-F和ULA-R扩增的LSADH基因，然后插入载体pTrc99A的NcoI-PstI位点，得到pTLA。引物ELA-F和ULA-R用于扩增lsadh，并将DNA片段插入载体pGEM5Zf的NdeI-PstI位点以得到pG5-LA。接下来，用NdeI和NotI双重消化pG5-LA，分离DNA片段，然后插入pET21b的NdeI-NotI位点以构建pELA。用XbaI和PstI双重消化pELA，得到DNA片段，将其插入质粒pUC118的XbaI-PstI位点，得到pUELA。用EcoRI和PstI进一步消化pUELA以分离DNA片段，将其连接到pKK223-3的EcoRI-PstI位点以构建pKELA。将质粒pULA，pKLA，pTLA，pUELA或pKELA导入大肠杆菌JM109中。将pELA引入大肠杆菌BL21（DE3）中。 还将pKELA引入大肠杆菌JM109 XL1Blue MRF0和BL21中。

重组LSADH的纯化。除非另有说明，所有纯化步骤均在0 ℃下在含有10%（v/v）甘油的20 mM KPB（pH 7.0）中进行。大肠杆菌BL21（pKELA）细胞在含有100 mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37 ℃振荡生长18小时。将从100 ml培养液中收集的洗过的细胞（1.17 g湿重）悬浮在20 ml缓冲液中，然后用超声波振荡器（Insonator 201M，Kubota，Osaka，Japan）破碎5分钟。离心（13,000times;g，30分钟）后，将上清液应用于用缓冲液平衡的DEAE-Toyopearl 650 M（Tosoh，Tokyo）柱（2.5times;13 cm）中。在相同缓冲液中用0至0.6 M NaCl梯度洗脱酶。收集具有强酶活性的洗脱液（总体积，28 ml）。将溶液与硫酸铵混合至浓度为0.6 M，将该溶液加到已用含有0.6 M硫酸铵的缓冲液平衡的Butyl-Toyopearl 650 M（Tosoh）柱（2.5times;13 cm）上。用0.6至0摩尔梯度的硫酸铵缓冲液洗脱酶。收集具有强酶活性的收集的级分（总体积，29 ml）并使用Centriprep YM-30（截留分子量30,000，Millipore，Billerica，MA）浓缩，并在20 ℃下作为纯化的酶制剂储存。

酶和蛋白质测定：在25 ℃用分光光度法测定活性，如先前使用三氟苯乙酮（PTK）作为底物的论文中所述，通过测量NADH在340 nm处的吸收降低一个酶单位定义为在1分钟内转化1 mmol NADH和PTK的量。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒估计蛋白质浓度，其中牛血清作为标准蛋白质。在具有Tris-甘氨酸缓冲系统的14.0%聚丙烯酰胺平板凝胶中进行SDS-PAGE。酶亚基的分子量由标准蛋白质的相对迁移率确定。

核苷酸序列登录号：本文报道的核苷酸序列可从登记号为AB213459，可从DDBJ，EMBL和GenBank数据库获得。

用异丙醇与NADH再生偶联生产手性醇。为了确定某些产品的对映体纯度并评估NADH再生的偶联系统，我们构建了一个含有LSADH和异丙醇的体系。用于测量酮产物的反应混合物由1 mmol NAD ，100 mmo

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