L-泛解酸内酯脱氢酶基因分析以及在L-泛解酸内酯立体特异性氧化中的应用

Dayong Si ，Nobuyuki Urano ，Shinya Nozaki ，Kohsuke Honda ，Sakayu Shimizu ，Michihiko Kataoka

摘 要: 1,2-丙二醇（1,2-PD）可诱导的膜结合L-泛解酸内酯（L-PL）脱氢酶（LPLDH），LPLDH已从红平红球菌AKU2103中分离。基于LPLDH的N-末端氨基酸序列和同源性搜索结果中的氨基酸序列高度相似，克隆LPLDH基因（LPLDH）。该基因由1179个碱基组成，编码形成了392个氨基酸残基的蛋白质。假定的氨基酸序列显示出与FMN依赖性alpha;-羟基酸脱氢酶高度相似。构建含有LPLDH及其上游区域的过表达载体pKLPLDH，并将其导入R. erythropolis AKU2103。生产含有pKLPLDH的重组红平红球菌AKU2103。LPLDH活性比野生型菌株高6倍。当底物浓度分别为0.768或1.15 M时，转化率为92％或80％，实现L-PL转化为酮戊酰内酯。LPL对D-PL的立体转化也通过使用含有pKLPLDH的重组红平红球菌AKU2103和降低酮基泛解酸内酯的大肠杆菌的组合进行。

关键词：L-泛解酸内酯脱氢酶， 红球菌， 酮基泛解酸内酯

一、引言

D-泛酰内酯（D-PL）是用于生产D-泛酸钙的重要手性中间体。PL（DL-PL）的外消旋混合物用作D-PL的工业生产中的起始材料，而仅D-异构体可用于下游步骤。尽管我们已经构建了有效的酮戊酰内酯（KPL）或酮戊酸（KPA）还原系统用于替代D-PL生产方法，但DL-PL仍然是目前最常见的可用于D-PL生产的原料。因此，许多研究都集中在DL-PL的酶促拆分以获得对映体纯的D-PL。主要方法是将DL-PL中的D-异构体或L-异构体立体选择性水解成相应的泛解酸（PA），然后通过溶剂萃取等从PL中分离PL.丝状真菌，例如尖孢镰刀菌， 赤霉素已被证明可催化D-PL向D-PA的立体特异性水解，而根癌土壤杆菌可催化L-PL的立体选择性水解。乳糖水解酶已经商业开发用于DL-PL的光学拆分。 在外消旋混合物中水解D-异构体后，其用于下一步骤，剩余的L-异构体必须进行再次消旋或丢弃。

在过去几年中，在对映体和光学活性醇的需求的推动下，已经开发了一些有效和实用的将外消旋体转化为单一立体异构产物的方法。解决DL-PL的理想方法是通过立体反转或对流-收敛过程等技术将其转化为对映体纯的D-PL。在这种情况下，DL-PL的理论摩尔产率将克服50％的限制并达到100％。为此提出了一种新颖的D-PL生产方法，即通过KPL或KPA将L-PL立体转化为D-PL（图1）。在该过程中，使用过表达KPL或KPA还原酶基因的大肠杆菌转化体细胞建立了KPL或KPA的有效还原系统；然而，没有构建用于将LPL氧化成KPL的有效系统。在红平红球菌AKU2103中发现了膜结合的L-PL脱氢酶（LPLDH），其催化L-PL的立体特异性脱氢而不对剩余的D-PL进行任何修饰。通过在红平红球菌AKU2103中添加1,2-丙二醇（1,2-PD）诱导LPLDH活性，但不足以实际使用。如果LPLDH基因（LPLDH）可以在重组微生物中过表达，则可以通过与KPL或KPA还原系统组合实现L-PL向D-PL的立体转化。我们在这里描述了LPLDH的克隆，其在红平红球菌AKU2103中的过表达，以及它在L-PL转化中的应用。

图1 通过KPL和KPA从DL-PL合成D-PL的酶促过程

二、材料与方法

2.1 化学品和试剂

D-PL和L-PL分别从Tokyo Chemical Industry Co.（日本）和Daiichi Fine Chemicals（日本）获得。KPL购自Sigma-Aldrich（USA）。KPA通过碱性水解由KPL制备（King等人，1974）。限制酶，Ex-Taq DNA聚合酶和PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自Takara-Bio（日本）。 本工作中使用的所有其他试剂均为分析级且可商购。

2.2 微生物和培养

R. erythropolis AKU2103（日本京都大学农学研究科），可以作为NBRC12539（日本NITE生物资源中心）获得，用作酶和DNA来源，或过表达宿主。培养基包含1％多肽，0.5%肉提取物，0.1%酵母提取物和0.5% NaCl，pH 7.0。必要时，加入1.2% 1,2-PD，10%蔗糖，225 mu;g/ml卡那霉素或30 mu;g/ml萘啶酸。培养在28 ℃下以300 rpm振荡进行48小时。使用大肠杆菌菌株JM109，BL21（DE3）和S17-1。所有大肠杆菌细胞在含有1% NaCl，0.5%酵母提取物和1% 胰蛋白胨，pH 7.0的LB培养基中于37 ℃生长。必要时，将100 mu;g/ml氨苄青霉素，50mu;g/ml卡那霉素和/或0.1mM异丙基-beta;-D硫代半乳糖吡喃糖苷加入LB培养基中。使用含有0.2% （NH ₄）₂ SO ₄，0.02% MgSO₄·7H₂O，0.05% NaH₂PO₄·H₂O，0.01% CaCl₂·2H₂O，0.05% K₂HPO₄和1% 碳源（pH 7.0）的最小培养基进行生长试验。LPLDH破坏突变体。

2.3 LPLDH的纯化和N-末端氨基酸序列分析

如前所述纯化LPLDH。LPLDH的N-末端氨基酸序列通过自动Edman降解方法用脉冲液体蛋白质测序仪模型491HT测定。

2.4 基因组和质粒DNA的制备

用DNeasy Blood and Tissue Kit分离红平红球菌AKU2103的基因组DNA。用QIAprep spin miniprep Kit分离质粒DNA。

2.5 通过简并PCR克隆部分LPLDH

氨基酸序列ETVAEAQR和YGEWMQTP用于设计简并PCR的引物。PCR混合物在50mu;l反应混合物中包含200 ng基因组DNA，25 pmol每种引物库，10 nmol dNTP和1.25单位Ex-Taq DNA聚合酶。一个热循环由96 ℃持续20秒，55 ℃持续30秒和72 ℃持续75秒组成。总共进行了35次循环。将PCR产物连接到pT7Blue T-载体中并测序。

2.6 克隆全长LPLDH和侧翼序列

基于红平红球菌PR4中推定的氧化还原酶基因侧翼的核苷酸序列设计寡核苷酸引物。 使用红平红球菌AKU2103的基因组DNA作为模板，以与上述相同的方式扩增完整的LPLDH和侧翼区域并测序。

表1 LPLDH的引物列表

2.7 表达载体的构建

基于LPLDH周围的核苷酸序列设计用于克隆具有上游区域（1,940bp）的LPLDH的引物LPLDH-pK4F和LPLDH-pK4R。PCR混合物含有150 ng基因组DNA，10 nmol dNTP，25 pmol每种引物和1.25单位的Ex-Taq DNA聚合酶，50 mu;l。程序在以下条件下进行30个循环：94 ℃30秒，50 ℃30秒和72 ℃ 4分钟。将PCR产物连接到pT7Blue Tvector中并测序。然后用EcoRI和KpnI消化质粒，并连接到用相同限制酶消化的pK4中。使用Urano等人的方法，通过电穿孔将得到的质粒pKLPLDH导入红平红球菌AKU2103中。除了含有225 mu;g/ ml卡那霉素的培养基用于选择成功的转化体。

2.8 DNA测序

通过双脱氧链终止法，用CEQ染料终止子循环测序试剂盒和自动测序仪DNA分析系统CEQ2000XL测定所有核苷酸序列。

2.9 粗酶的制备和酶活的测定

将红平红球菌AKU2103细胞在5 ml补充有或不含225 mu;g/ml卡那霉素的培养基中于28 ℃培养48小时。对于大规模培养，将预培养物（5 ml）转移到含有300 ml培养基的2升摇瓶中，然后在28 ℃下往复摇动（100次/分钟）进行培养。通过离心收获培养的红平红球菌AKU2103细胞，然后悬浮于1 ml含有0.1 mM二硫苏糖醇的10 mM Tris-HCl（pH 7.4）中。然后用超声波振荡器破碎后将溶液搅拌2.5小时。离心后，用前述方法将所得上清液用于LPLDH活性测定。一个单位的LPLDH定义为在标准测定条件下每分钟催化形成0.5 mu;mol二甲双嗪的量。

2.10 LPLDH基因诱变和生长试验

为了产生LPLDH破坏突变体，通过重叠延伸PCR扩增含有Delta;LPLDH和侧翼区的3-kb片段AD。使用Prime STAR Max DNA聚合酶和野生型红平红球菌AKU2103的基因组DNA作为模板，分别用引物LPLDH-A/-B和LPLDH-C/-D扩增片段AB和CD。电泳后，用illustra GFX PCR DNA和Gel Band Purification Kit回收片段。然后用引物LPLDH-A/-D和片段AB和CD的混合物作为模板扩增片段AD。在扩增的片段AD中，除去部分LPLDH。在连接到pT7Blue T-载体中并用EcoRI和HindIII消化后，将该片段连接到用相同限制酶消化的宽宿主质粒pK18mobsacB中以构建pK18Delta;LPLDH。通过两步同源重组构建了红平红球菌AKU2103中LPLDH的缺失诱变。将含有pK18Delta;LPLDH的重组大肠杆菌S17-1细胞与等量的红平红球菌AKU2103细胞混合，并涂布在非选择性平板上，得到含有pK18Delta;LPLDH的结合物。用补充有30 mu;g/ml萘啶酸和225 mu;g/ml卡那霉素的选择平板选择质粒整合到基因组DNA中。挑取抗卡那霉素和抗萘啶酸菌落并再次扩散到非选择性平板上以促进第二次同源重组。通过将细胞从第二非选择性平板转移至补充有10% 蔗糖和30 mu;g/ml萘啶酸的选择性平板来进行质粒的切除。

R. erythropolis AKU2103细胞在完全培养基中培养24小时。离心后，用不含碳源的基本培养基洗涤细胞两次，并悬浮在相同的溶液中。将洗过的细胞接种到5 ml含有不同唯一碳源（葡萄糖，乙酸，乳酸，乙醇，1,2-PD，1-丙醇，甘油，1-丁醇，1-己醇，聚乙二醇）的基本培养基中。然后在28 ℃下以300 rpm振荡培养。在24，48，60和72小时测量培养物的OD₆₀₀。以及通过红细胞内AKU2103（b）中的两步同源重组破坏LPLDH。卡那霉素抗性基因，枯草芽孢杆菌的sacB修饰的左聚糖蔗糖酶基因，lacZalpha;3-截短的lacZ基因，含有多克隆位点（MCS）。编码852 bp，编码LPLDH中间的284个氨基酸残基。第1次同源重组后获得两种整合。Km用于筛选含有pK18Delta;LPLDH的缀合物。在第二次重组后，sacB用于反选择LPLDH破坏突变体。在含有10%蔗糖的平板上生长的细胞进行第二次同源重组并丢失质粒，从而恢复野生型菌株或导致突变菌株

图2 通过重叠延伸(a)构建pK18Delta;LPLDH的构建图

2.11 将L-PL转化为D-PA

通过离心收获大规模培养的细胞，用生理盐水洗涤并储存在-20 ℃直至使用。在5 ml由0.2 M磷酸钾缓冲液（pH7.0），15 mg/ml CaCO₃，0.230-1.15 M（30.0-150 g/L）L-PL组成的反应混合物中测量L-PL至KPL的转化率。和R. erythropolis AKU2103细胞。将混合物在28 ℃下以300 rpm振荡温育。在将L-PL转化为KPL后，将0.018 g冻干的大肠杆菌，0.270-1.39 M葡萄糖和0.1 mg/ml NADP 加入到反应混合物中，然后混合物将其在28 ℃下以300 rpm振荡温育24小时。在反应过程中，定期用12 M KOH将pH调节至7.0。如前所述，移出一部分反应混合物（250 mu;L）并进行分析。氧化产物KPL将自发水解成KPA，因此酸性KPA的形成应引起反应混合物的pH下降。为了避免反应混合物的pH急剧下降，这导致LPLDH反应减慢，将CaCO₃加入到反应混合物中。

2.12 核苷酸序列登录号

利用登录号AB689131将LPLDH基因的核苷酸序列和红平红球菌AKU2103的侧翼区保藏在DDBJ/GenBank/EMBL核苷酸序列数据库中。

三、结果

3.1 LPLDH的N-末端氨基酸序列

纯化的LPLDH的N-末端氨基酸序列被成功分析为FFETVAEAQRRAKKRLPKSVY。 使用BLASTP程序和RefSeq数据库进行计算机辅助同源性搜索。 LPLDH的N-末端氨基酸序列与R.

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