吡哆醇补充改善重组谷氨酸的活性，脱羧酶和酶的生产gamma;-氨基丁酸

摘要

谷氨酸脱羧酶（GAD）催化L-谷氨酸不可逆脱羧到有价值的食物补充剂gamma;-氨基丁酸（GABA）。在这项研究中，GAD来自大肠杆菌K12（磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶）过表达

在大肠杆菌中。在补充有0.05mM可溶性维生素B6类似物的培养基中产生的GAD吡哆醇盐酸盐（GAD-V）活性为154.8 U mL-1，比其高出1.8倍。GAD获得补充为GAD-C，纯化的GAD-V表现出增加的活性（193.4 U mg-1，比​​GAD-C高1.5倍），优异的热稳定性（2.8倍大于GAD-C）和更高的kcat / Km（比GAD-C高1.6倍）。粗制GAD-V转化500gL-谷氨酸单钠（MSG）转化为GABA，产率100％，750g/L MSG，收益率为88.7％。这些结果确立了吡哆醇补充的效用，并奠定大规模酶促生产GABA的基础。

介绍

gamma;-氨基丁酸（GABA）是一种广泛分布的四碳非必需氨基酸。在自然界中，对于哺乳动物中枢抑制性神经递质起着主要作用。 GABA有多种生理活动，包括利尿剂和镇静剂作用，并已用于治疗癫痫和预防肥胖。目前，GABA被广泛用于降低血氨浓度和治疗肝昏迷。 GABA也因其作为生物聚合物的潜在用途而受到关注。 例如，GABA可以转化为2-吡咯烷酮，一种尼龙的单体。由于其多种功能，GABA广泛用于医药，功能性食品和食品化学工业。

目前的GABA生产方法包括从食品，化学合成中富集和生物合成。 通过食物富集获得的GABA量非常低;它被用作GABA绿茶和GABAbrown等产品的营养补充剂。 GABA的化学合成消耗大量的能量，而且不环保。 最近从传统产品中分离生产GABA的乳酸菌发酵食品吸引了很多关注。 然而，最高的水平通过发酵生产的GABA仅达到35.6 g /L。 此外，通常从这些生物体所需的复合发酵液中回收GABA执行困难且代价高昂。 这些缺点限制了GABA的广泛使用。

相反，酶合成使用5-磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶谷氨酸脱羧酶（GAD）催化L-谷氨酸不可逆脱羧到GABA，在温和条件下以低成本和低能耗进行。因此，作为工业用GABA的方法，非常希望酶合成生产。 由于GABA的工业重要性，谷氨酸脱羧酶具有在各种宿主中过表达以改善GABA生产。 在迄今报导的GAD酶中，来自大肠杆菌K12的GAD表现出最高的GABA产量，达到280 g/L。 因此，大肠杆菌GAD在大肠杆菌BL21（DE3）中过表达在本研究中进一步被研究。

GAD需要PLP的谷氨酸脱羧酶活性。虽然PLP可以通过细菌中吡哆醛的磷酸化生成，但这条路线不能满足重组GAD生产的需求。因此，大多数研究人员添加了一定数量的PLP转化为酶促混合物转化以协助GABA的生产。现在，只有Plokhov et.al报道了一种制法，其中加入0.02 mM PLP发酵培养基来提高GAD的产量。 GAD的产量增加，在0.02 mM PLP存在下为2.5倍。但是，价格高，可用性差，而且PLP的稳定性差限制了其工业应用。更合适的选择是维生素B6补充盐酸吡哆醇（PN），一种存在的水溶性维生素，在自然界广泛存在，可被细胞摄取，并在细胞内磷酸化形成辅酶PLP。在这项研究中，一株携带GAD表达的大肠杆菌BL21（DE3）构建质粒并用于过表达大肠杆菌GAD。 PN添加到介质中发酵显着改善了在GABA生产中的GAD的产量及其性能。因此，这个过程可能会降低GABA生产的成本，有着广阔的商业前景。

材料和方法

细菌菌株，质粒和材料使用大肠杆菌菌株JM109和BL21（DE3）作为克隆载体和表达宿主。 EZ-10Spin Column Plasmid Mini-Prep试剂盒和琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒购自天根有限公司（北京，中国）。 载体pMD TM 18-T和pET-24a（ ）购自Novagen（中国上海）。 PrimeSTAR1HS DNA聚合酶，限制性酶和T4 DNA连接酶获自Takara（大连，中国）。限制性内切酶DpnI获自Generay Biotech（中国上海）。GABA，PLP和1,2-邻苯二甲酸二甲醛获自Sigma Chemical Co.Ltd。（Shanghai，中国）。 其他化学品购自国药集团化学试剂有限公司（SCRC，中国上海）

质粒和菌株构建

大肠杆菌菌株的gadB基因（NCBI登录号：NP_416010） K12 substr。 MG1655是使用准PCR方法从基因组DNA扩增。期间使用的正向引物该过程是5-CGCCATATGGACCAGAAGCTG TTAACGGAT-3（NdeI限制性位点下划线），反向引物是5-CCGCTCGAGTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTCT-3（XhoI限制性位点用下划线标出）。用PrimeSTAR1HS DNA进行扩增聚合酶。扩增产物被分离并直接连接到克隆载体中。然后用pMD18T-simple转化化学感受态大肠杆菌JM109细胞。使用酶限制分析验证质粒的身份，其序列为通过由Sangon Co.Ltd。进行的DNA测序验证。验证的质粒用NdeI和XhoI消化，并将含有gadB的片段克隆入载体中表达载体pET-24a（ ）。重组质粒，gadB / pET-24a（ ）扩大了JM109并用于转化的大肠杆菌BL21（DE3）用于过表达。

重组谷氨酸脱羧酶的表达

含有所需质粒gadB / pET-24a（ ）的大肠杆菌BL21（DE3）在Luria-Bertani培养基中添加30mu;gmL-1卡那霉素，37℃培养8 h，200℃振荡培养转。将该种子培养物稀释到Terrific Broth培养基中，并以200rpm振荡25℃。当600nm处的吸光度达到1.5时，酶的产生被诱导加入异丙基-beta;-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2mM。将细胞再温育24小时，在此期间每3天培养一次。在24小时孵育结束时，通过以12,000g离心2分钟收集细胞在4°C。这些细胞含有在不添加PN的情况下产生的酶（GAD-C）直接用于下述纯化方案中。为了研究PN对重组谷氨酸脱羧酶功能特性的影响，培养基补充有各种浓度的PN（终浓度）0.01，0.02,0.03,0.04,0.05和1mM）。酶在PN（GAD-V）存在下产生的蛋白质也使用所述方案纯化

重组谷氨酸脱羧酶的纯化

将细胞沉淀洗涤两次，然后重新悬浮于50mM柠檬酸-Na 2 HPO 4缓冲液（pH7.5）中

5.5），然后通过超声波破碎（Vibra-cell; Sonics＆Materials，Newtown，CT，USA）以20kHz在冰浴中保持10分钟。通过10,000g离心澄清裂解物在4℃保持10分钟。在搅拌下将固体硫酸铵缓慢加入到上清液中，达到60％（w / v）的最终浓度。将溶液保持在4℃过夜沉淀

蛋白质。通过离心收集沉淀并溶于缓冲液A（20mM柠檬酸-Na 2 HPO 4缓冲液，pH6.5，含有0.15mM PLP），并针对1mu;L的透析液进行透析缓冲液A在4℃过夜。将样品过滤（0.22mu;m）并加载到DEAE-Sepharose上用缓冲液A预平衡的柱子。柱子使用线性梯度洗脱在缓冲液A中0-1M NaCl，流速为1.0mL min-1。含有谷氨酸的级分合并脱羧酶活性并在4℃下针对1L缓冲液A透析。纯化的蛋白质的均一性和亚基分子量通过变性SDS-PAGE。通过用0.25％Coomassie Brilliant染色显现蛋白条带蓝色R-250。密度测定是通过扫描凝胶并分析扫描进行的使用Quantity One 4.6.2软件（Bio-Rad Laboratories，Calif，USA）凝胶成像。蛋白质浓度使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad）和纯化的牛来测定血清白蛋白（Promega）作为标准。纯化的酶储存在-20℃。

谷氨酸脱羧酶活性测定

通过测量产生的GABA的量来确定谷氨酸脱羧酶活性， 使用HPLC。 一个单位（U）的谷氨酸脱羧酶活性定义为 在下面的活性测定中每分钟释放1mu;molGABA的酶的量 条件。 反应混合物中含有最终体积为400mu;L的100mM谷氨酸， 50mM柠檬酸 - Na 2 HPO 4缓冲液（pH 4.8）和0.15mM PLP。 通过加入引发反应 的等分试样的酶。 在37℃孵育4分钟后，反应停止 加入600mu;L0.2M硼酸盐，pH10.0，并煮沸10分钟以灭活酶。该 通过将反应混合物在室温以12,000g离心10分钟获得上清液 使用HPLC测定法中所述的HPLC测定程序分析温度 GABA。 报道的谷氨酸脱羧酶活性代表三种独立的手段 测量值plusmn;其标准偏差。

pH最适和稳定性

使用谷氨酸脱羧酶活性测定中所述的测定方法，在pH 3和pH 7之间测量pH对谷氨酸脱羧酶活性的影响，除了将反应缓冲液50mM柠檬酸-Na 2 HPO 4调节至pH值 在pH 3.0和pH 7.0之间，以1个pH单位为增量。 为了确定在这些pH值下酶的稳定性，将样品在4℃下在上述每种反应缓冲液中温育，补充0.15mM PLP 24小时。 在温育期结束时，使用谷氨酸脱羧酶活性测定中所述的测定评估每个样品中的残留GAD活性。

温度最佳和热稳定性

温度对酶活性的影响使用章节中描述的测定来确定 谷氨酸脱羧酶活性测定，除了在30℃至60℃的温度范围内。 在开始反应之前，将底物溶液和酶预温育 分别在适当的温度下7分钟。 加入引发反应 的酶并允许进行4分钟。 通过将酶在50mM柠檬酸中温育来确定酶的热稳定性 酸性Na2HPO4缓冲液，pH4.8，含有0.15mM PLP，在37℃下。 反应混合物是 定期取样并使用章节中描述的方法测定残余活性 GABA的HPLC分析

动力学研究

使用谷氨酸脱羧酶测定GAD-C和GAD-V的反应动力学 在谷氨酸脱羧酶活性测定中描述的测定，除了谷氨酸 浓度通常在5mM至200mM的范围内。 速率与底物浓度 使用GraphPad Prism通过非线性回归将数据拟合至Michaelis-Menten方程 版本5.0软件。 报道的Km和kcat值表示三个独立的手段 测量值plusmn;其标准偏差。

尺寸排阻色谱法

尺寸排阻层析使用AKTA avant 25 System（GE Healthcare， USA）配备Superdex 200 10 / 300GL柱（GE Healthcare，USA）。 洗脱 缓冲液是20mM柠檬酸-Na 2 HPO 4缓冲液（pH 6.5，含有0.15mM PLP）。该 以0.4mL / min的流速洗脱纯化的GAD-C和GAD-V，并使用280nm的UV光谱法监测柱流出物。 五种肽，包括蓝色葡聚糖，Apoferritin 来自马脾，beta;-淀粉酶，来自酵母的乙醇脱氢酶和碳酸酐酶 来自牛用作分子量标准品（Sigma-Aldrich，上海，中国）。

圆二色性分析

使用BioLogic Mos-450分光偏振计进行圆二色性（CD）分析 （BioLogic Science Instrument，格勒诺布尔，法国）配备1毫米石英比色皿。该 将样品在20mM柠檬酸Na 2 HPO 4中稀释至0.05-0.20mg / mL的蛋白质浓度 缓冲液（pH6.5，含有0.15mM PLP）。 酶的椭圆率数据是连续的 收集在远紫外（195-250 nm）光谱中。 二级结构内容 使用DichroWeb上的CDSSTR算法（http：// www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb）

优化GABA生产的反应条件

为了优化从L-谷氨酸生产GABA的一系列反应 确认最佳的pH，温度，酶浓度和底物浓度。 谷氨酸味精（MSG），其溶解度高于谷氨酸 酸，被选作底物。 MSG（250g/L）溶于50mM柠檬酸Na 2 HPO 4中 缓冲液，在所指示的pH下，含有0.15mM PLP至最终体积10mL。 反应在连续搅拌的恒温恒温摇床中进行 在150rpm。 加入等体积的1mol？L-1终止反应 氢氧化钠。 然后如HPLC中所述通过HPLC分离和定量反应产物 切片HPLC分析GABA。 所有数据是三次独立实验的平均值。

用粗酶GAD合成GABA

用含有未知浓度的粗酶的GABA合成 PLP在1L反应体系中进行测试。 在最优化条件下优化 GABA生产的反应条件，溶于50mM柠檬酸Na 2 HPO 4中的MSG（250g L -1） 缓冲液，pH 5.0，用作初始浓度。 在第一个4小时后，再增加50个 每2小时添加1g / L MSG，直至MSG添加总量达到500g L-1或750g L-1。 加入最后的底物（分别在500和750g L-1）后，继续反应 额外的12小时。 加入等体积终止反应 的1mol？L-1 NaOH。 MSG和GABA的最终浓度使用 在GABA的HPLC测定中描述的HPLC方案。 所有的数据是三个数据的平均值。

GABA的HPLC分析

测定反应混合物中存在的GABA和谷氨酸或MSG的量 使用HPLC和Agilent 1200 HPLC系统（Agilent Technologies，Palo Alto，CA， USA），配备Eclipse XDB-C18 5mu;m（4.6 mmtimes;150 mm）色谱柱（Agilent Technologies）。 分析使用流动相进行梯度洗脱， 缓冲液A（4.52g L-1无水乙酸钠，200mu;LL-1三乙胺，5mL L-1四氢呋喃， pH7.2plusmn;0.05）和缓冲液B（22.6g L-1无水乙酸钠，pH7.2plusmn;0.05 /乙腈/甲醇） = 1：2：2，体积），由陈等人描述。 [25]。柱温是 保持在40°C，流速为0.8 mL min-1，产物在338 nm检测 用UV

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