一种醛类高灵敏度检测方法及其在葡萄干和奶粉的糠醛分析中的应用

摘要

已经应用基于硝酮形成的预柱荧光衍生化方法来首次测定食品样品中的糠醛（F），5-甲基糠醛（5-MF）和5-羟甲基糠醛（5-HMF））.使用N-取代的羟胺试剂4 - （（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）与糠醛的醛基反应形成具有高荧光强度的稳定的硝酮衍生物.反应在温和条件下进行30分钟，衍生化率高（gt; 93％）.随后在反相柱上25分钟内完成三种糠醛衍生物的基线分离.检测限在femtomol低水平（S / N = 3，每次注射20mL）.校准曲线的线性范围为0.4e4000 nM，相关系数良好（R2gt;0.9991）.所提出的方法进一步应用于食品样品分析，如牛奶粉和葡萄干.在94.7％e103.5％的范围内获得了令人满意的回收率.最重要的是，这种前柱衍生化方法简单，快速，高度灵敏，为未来醛类在不同基质中的研究提供了有效和有希望的途径.

介绍

糠醛，包括糠醛（F），5-甲基糠醛（5-MF）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）作为一组重要的呋喃醛可以在各种食品中发现，如牛奶[1,2 ]，葡萄干[3,4]，面包[5]，果汁[6]，蜂蜜[7]，醋[8]和葡萄酒[9,10]等. 它们是由于热处理或长存储时间而导致的糖的降解产生的[3,9]. 糠醛外观可导致这些食品中的颜色，质地和风味变化[12,13]. 此外，有几项研究指出，F，5-MF和5-HMF可能具有致突变性和遗传毒性作用[14,15]. 这些化合物对人类中枢神经系统有负面影响当这些化合物浓度超过人体吸收的极限时，这些化合物对人体中枢神经系统，肝脏，肾脏，心脏和其他器官具有负面影响[16].因此，开发一种简单，快速和敏感的方法来确定不同食品中糠醛的存在至关重要.
已经开发了许多方法，包括分光光度法[17e19]和色谱法（例如气相色谱（GC）[10,20-22]和高效液相色谱（HPLC））方法[23-26].一方面，分光光度法更简单，成本更低，但是经常受基质影响和选择性不足的阻碍.另一方面，采用超紫色检测（LC-UV）的液相色谱法已经应用于食品中的糠醛测定，但其检测限通常高于GC与质谱联用质谱法（GC-MS）.不幸的是，GC-MS通常需要几个分析步骤，包括在分析前提取和衍生化[21,27].高效液相色谱法与质谱联用或荧光检测（FLD）具有高灵敏度和高选择性，常用于给定基质的高效分析. 广泛用于增强分析物的疏水性和光谱响应，荧光衍生化也被用于测定通过HPLC-FLD测定糠醛的含量. 例如，Donnarumma等人 [25]报道用荧光丹酰肼（DNSH）标记测定人血浆中的5-HMF，并在皮摩尔水平达到低检测限（LOD）.我们的实验室最近合成了一种醛反应剂4 - （（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）[28]. 该试剂显示出良好的荧光性质，高达0.61的量子产率. 在HAHC中，香豆素作为荧光团核心和N-单取代羟胺基团作为反应物结束（图1）. 因此呋喃醛可以通过与HAHC的缩合反应来标记，得到没有异构体形式的硝酮衍生物（图2）. 此外，长链脂肪族碳链也有望增加衍生物的疏水性并改善其色谱行为[29].这项工作的目的是实现使用HAHC作为衍生化试剂的硝酮形成方法，其允许使用HPLC-FLD定性和定量分析食品中的糠醛. 对几个反应参数进行优化以在温和条件下实现高衍生化产率. 我们还调查了在荧光和质谱检测中用HAHC标记的糠醛的信号增强. 最后，通过分析干葡萄干和牛奶粉样品中的糠醛来验证该方法. 我们认为这种衍生化方法与N-取代羟胺类试剂在各种来源的醛类的灵敏分析中具有很大的潜力.

2.实验

2.1. 材料和化学品

4 - （（羟基氨基）丁基）-7-羟基香豆素（HAHC）在我们的实验室合成. 5-羟甲基糠醛，糠醛，5-甲基糠醛和丹酰肼购自J＆K Scientific（Beijing，China）. 脂肪醛C1-C6包括甲醛（C1），乙醛（C2），丙醛（C3），丁醛（C4），戊醛（C5），己醛（C6），购自阿拉丁（中国上海）. 醋酸钠，醋酸钠，醋酸铵，磷酸，磷酸二氢钾，三氟醋酸和苯胺均购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）. 葡萄干是从天安食品有限公司（中国安徽）购买的. 牛奶粉购自蒙牛乳业有限公司（中国内蒙古）. 除非另有说明，本研究中使用的所有试剂均为分析试剂级. 过滤器（N66,13mmle;0.22mm）购自Jinteng（中国天津）. 超速离心管（再生纤维素，5KMWCO）购自MilliporeAmicon（MA，USA）.

2.2. 设备和试剂
在具有20mL样品环的注射器，Shimadzu RF-20荧光检测器和色谱数据采集软件的Shimadzu（Kyoto，Japan）LC-20A系统上进行色谱分析. 分离在反相HPLC柱（Agilent Eclipse XDB-C18,5mm，4.6？ 150毫米）. 液相色谱级乙腈（ACN）购自Fisher Scientific（Pittsburgh，PA，USA）. 水是Milli-Q级的. 在RF5301荧光光谱仪（Shimadzu，Tokyo，Japan）上记录荧光光谱，在Lambda 10紫外/可见光谱仪（Perkin-Elmer）上记录UV / Vis光谱， 1厘米石英池. 使用pH计（PB-10，Sartorius，USA）测定pH值.

2.3. NanoLC-ESI-MS分析
在具有纳流喷雾源的Triple-TOF 5600系统（AB SCIEX，USA）上测量电喷雾电离质谱（ESI-MS）.用C18（5mm，0.15-150mm）柱在NanoLC Ultra System（Eksigent，USA）上进行样品分离的洗脱模式.柱温保持在25℃.用含有0.1％甲酸的乙腈 - 水（0.5 / 9.5，v / v）和乙腈 - 水（9.5 / 0.5，v / v）分别进行洗脱.使用25mL的溶剂A和25mL的甲醇溶液来溶解样品.将2.4mL等份的溶液以2.0mL min -1的流速加载到捕获柱中10分钟.使用流速为300nL / min的梯度洗脱进行分析分离，并使用3psi的离子源气体，35psi的帘幕气体，2.3kV的离子喷雾电压和界面加热器温度为150？C. ESI-MS采用正离子模式，质量范围为20e2000 m / z.采用IDA（信息相关采集）模式扫描20个最丰富的前体离子，电荷数为1〜4.使用PeakView 1.2软件（AB SCIEX，USA）处理结果数据.

2.4. 荧光分析
将HAHC溶于乙腈 - 水（1.0 / 9.0，v / v）至浓度为2mM. 对于发射光谱，激发波长保持在322nm，发射波长从350nm到600nm扫描. 对于激发光谱，发射波长保持在447nm，激发波长为200-400nm.

2.5. 衍生程序
在标准衍生化过程中，将20mL HAHC溶液（1mM），10mL标准糠醛溶液，10mL苯胺溶液（20mM）和10mL乙酸钠缓冲液（0.1M，pH3.5）在 一个塑料离心管. 将混合物在室温（20℃）下保持30分钟，随后用高效液相色谱法进行荧光检测（HPLC-FLD）分析. 除了添加标准糠醛以外，试剂空白通过相同的程序进行.

2.6. 色谱分离
样品通过使用C18柱的HPLC系统以1mL min -1的流速进行分析，分别在激发和荧光发射波长322和447nm处进行荧光检测. 在分析之前，C18柱用流动相预平衡30分钟. 将20mL等份的制备的测试溶液注入. 柱温保持在30℃. 洗脱遵循二元梯度分离.
洗脱液A为乙腈 - 水（0.5 / 9.5，v / v），洗脱液B为乙腈. 梯度：0e12分钟，13％B; 12分30秒，20％B.

2.7. HAHC和DNSH标记后的色谱图比较
DNSH标记：根据参考文献[25]采用三种含DNSH的糠醛的衍生化程序. 三种糠醛的注射浓度各为0.02mM. 色谱分离如参考文献[25]所述进行. 荧光检测器的激发和荧光发射波长分别设定在350和525nm. 分离遵循二元梯度模式. 洗脱液A是磷酸盐缓冲液（20mM，pH2.5），洗脱液B是乙腈. 梯度：0e4分钟，30％B; 4e9 min，30％B至60％B，流速保持在1 mL / min，保持柱温
在30？C.
HAHC标签：2.5节描述了三种糠醛的衍生化过程. 三种糠醛的注射浓度各为0.02mM. 第2.6节描述了色谱分离.

2.8. 方法验证
通过分析从LOQ（信噪比= 10）值到4mM的不同浓度的三种糠醛的标准混合物计算线性度. 日内精密度通过在同一天的标准糠醛样品的六次重复来测量，并且在三天内通过使用相同的方法来确定日间精确度.
通过在样品制备程序之前在中和高浓度（0.4mM和1mM）的加标样品的分析确定回收率. 将加标样品的计算浓度和预期浓度（C）进行比较以使用以下等式确定回收值：回收率（％）= [Cspiked sample / Cexpected]？100.

2.9.样品制备
葡萄干：干葡萄干的样品制备按照参考文献[4]进行，略作修改.简言之，在50mL离心管中精确称量5.0g样品.然后将5mL甲醇和20mL 0.02M乙酸铵溶液（用醋酸预先调节至pH4.5）加入到该离心管中并超声混合30分钟.将混合物的上清液通过0.22mm过滤器（尼龙66）过滤，并在衍生之前转移到新的塑料离心管中.衍生化之前将样品稀释10倍.

奶粉：样品预处理遵循先前描述的程序[30]，稍有改变.简言之，精确称量5.0g样品并用温水溶解至25mL.将溶液超声混合10分钟.然后向溶液中加入1mL乙酸 - 水（2.5 / 7.5，v / v），然后加入甲醇至50mL体积.将混合物充分混合，然后在具有分子量的超滤管（再生纤维素膜）中以6000rpm离心2小时，重量截止5000 Da.然后将滤液通过0.22mm过滤器过滤并转移到新的塑料离心管中.衍生化前将样品稀释2.5倍.

3.结果与讨论

3.1.与HAHC衍生化
HAHC是由作者合成的新型荧光试剂.在我们以前的工作中已经描述了HAHC的合成程序和表征[28]. HAHC的激发和荧光发射波长分别被确定为322和447nm（图3）.在我们最初的尝试中，我们选择F作为模型呋喃醛，在50℃下与HAHC反应1h，然后进行HPLC-FLD分析.与对照相比，在HPLC谱中观察到一个新的峰（tR：9min），并鉴定为F-HAHC衍生物（参见图4A）.然后收集对应于该峰的洗脱液并进行荧光和ESI-MS检测.得到的荧光光谱（图S1）显示F-HAHC衍生物和HAHC具有相同的lex和lem，表明FHAHC衍生物的荧光由HAHC部分决定.
通过ESI-MS（图4B）检测m / z 328.12的离子，对应于理论m / z值为328.1182的F-HAHC衍生物.此外，ESI-MS / MS谱的详细信息披露了F-HAHC衍生物离子可能会碎裂
碳 - 氮键和邻近呋喃的碳 - 氮双键（图5）.主要碎片离子（m / z 217.09）属于HAHC部分，离子较少（m / z 81.03）属于糠醛部分.总之，这些结果表明糠醛被HAHC成功地标记，产生单一的F-HAHC硝酮衍生物. 这一观察结果与先前的研究结果一致[31,32]，作者证明，醛与N-单取代的羟胺的缩合产生单一硝酮产品没有异构体形式. 请注意标记试剂如2,4-二硝基苯肼（DNPH）[26]，DNSH [25]和O-（2,3,4,5,6-五氟苄基）羟胺盐酸盐（PFBHA）[27]给出了每个糠醛的两个峰， 它们的衍生物可以以E-和Z-异构体形式存在. 相反，我们的衍生化方法只产生一个明确的异构体，这简化了色谱图并且便于糠醛混合物的分析.

3.2. 衍生化条件的优化
我们接下来使用单因素分析来研究可能影响衍生效率的各种参数，包括反应时间，反应温度，pH值和衍生化试剂量. 结果显示在图6中.我们使用HPLC谱中产物峰的面积来估算衍生化效率. 峰面积越大，衍生效率越高.通过监测在50℃的水浴中进行的反应来研究反应时间的影响. 如图6A所示，在4小时的反应时间，糠醛衍生物的峰面积稳定. 因此，4小时被确定为最佳反应时间.

研究了反应温度在25℃〜70℃范围内. 如图6B所示，衍生物的峰面积在50℃时最大. 当反应温度超过50℃时，衍生物的峰面积减小，这可能是由于硝酮衍生物在较高温度下的不稳定性.因此，50℃被确定为最佳反应温度.
由于在酸性条件下醛和羟胺的缩合是有利的[33]，使用醋酸钠缓冲液在3.0e5.0的pH范围内进行衍生化反应的进一步优化（图6C）. 峰面积在pH 3.5时最大化并将此值确定为最佳pH值.

通常，在荧光衍生中，需要过量的标记试剂以确保衍生效率和再现性. 但是，过量的试剂可能导致LC色谱柱过载和色谱峰拖尾，因此需要选择适量的试剂. 如
如图6D所示，增加HAHC浓度最初导致峰面积的增加. 但是，当HAHC浓度达到0.4mM及以上时，峰面积几乎保持恒定. 因此，选择0.4mM作为优化的HAHC衍生化.

这些结果表明，在50℃下进行4小时的衍生化反应将提供最高的衍生化效率. 然而，当在85℃加热时，果汁中可形成5-HMF [34]，表明在实际样品分析期间应避免高温，尤其是在高糖食物中. 因此，为了在相对较低的温度下补偿良好的衍生效率，需要选择合适的催化剂.

据报道，苯胺作为亚胺形成反应的亲核催化剂（例如肟形成和还原胺化[35]）是根据亚胺交换机理[36].在这项研究中，我们首次发现苯胺对硝酮形成反应也有相当的催化作用.如图7A所示，当不添加苯胺时，衍生物的峰面积在4小时最大化.

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