论文总字数：9674字

摘 要

随着工业革命的程度化的加深，能源危机和环境问题一直以来都困扰着人们，人类开始寻找高效清洁的能源替代物，生物柴油作为石油燃料的添加剂，可以部分替代化石能源，表现出环境友好和价格低廉等优点。因此本文就油酸与甲醇进行甲酯化反应合成生物柴油进行研究，从脂肪酶的催化反应的机理以及其进行酯化反应的基本规律等方面入手，考察了三种不同类别的脂肪酶对甲酯化反应的催化活性，然后就活性较好的S3脂肪酶，分别对反应温度、反应时间、底物酸醇投料比、分散介质、甲醇的投料次数、酶的用量等因素对整个酯化过程进行了详细研究，研究出了最佳反应条件，欲制备酯化率较高的生物柴油，应在35 ℃下，选用石油醚作为分散介质，油酸和甲醇的投料比为1:1.5，甲醇分三次加入，用4 % wt S3脂肪酶催化反应，反应时间为24 h，最终产物的酯化率可达到33 %。

关键词：S3脂肪酶，生物柴油，油酸，酯化反应

Abstract：With the deepening of the industrial revolution, energy crisis and environmental problems have always troubled people. Humanity has begun to look for efficient and clean energy alternatives. As an additive for petroleum fuels, biodiesel can partially replace fossil fuels and show environmental friendliness and the advantages of low prices. Therefore, this paper explores the synthesis of biodiesel from the methylation reaction of oleic acid and methanol. The mechanism of the catalytic reaction of lipase and the basic rules of the esterification reaction are discussed. Three different types of lipases are explored. The catalytic activity of the esterifiabe reaction, and then on the activity of the better S3 lipase, respectively, the reaction temperature, reaction time, substrate acid alcohol ratio, the dispersion medium, the number of methanol feed, the amount of enzyme and other factors on the entire esterification process A detailed study was conducted to explore the optimal reaction conditions. To produce biodiesel with a higher esterification rate, petroleum ether was used as the dispersion medium at 40 °C, and the feed ratio of oleic acid to methanol was 1:1.5. In three separate additions, the reaction was catalyzed by 4% wt S3 lipase. The reaction time was 24 h and the esterification rate of the final product reached 33%.

Keywords：S3 lipase, biodiesel, oleic acid, esterification

前言

目前世界上许多国家都已开始对生物柴油技术进行研究，并在产业化方面取得了突破性进展。近年来随着西方一些国家对于柴油的需求量逐渐增大，越来越多的科研工作者都在力争在生物柴油方面有所突破，一些西方国家政府也因此大力扶持生物柴油的研发工作，该产业一下子得到了迅猛发展。其中以美国为代表的一些国家主要是以大豆为原料制备生物柴油，也有一些其他欧盟国家以菜籽油为原料，他们的原料大都是以粮油产物为主^[1-3]。然而基于我国目前依旧是人口大国，人均耕地占有量还不足0.1公顷，粮食的产出主要还是用在居民日常消耗，因此完全利用农产品为去生产生物柴油在我国尚且还是不太实际的。此外，我国对于开发和利用生物柴油的技术还不成熟，还不能完全满足工业化的需要，并且我国还是个石油零出口国，石油储存量有限，大量进口石油对我国能源安全等造成空前的威胁^[4]。因此，合理开发好生物柴油的资源对于我国的农业产业结构调整、能源的开发和环境治理等方面有重大意义。二十一世纪以来，随着工业革命的一次次升级，世界柴油需求量急剧上升，然而柴油资源的世界存储量有限，这些问题都为生物柴油的发展提供了广阔的前景。就当前而言，对于制备生物柴油比较成熟的生产工艺依旧是借助传统的酸碱催化化学法^[5]，该合成方案主要是将一些油类物质和醇类在酸碱催化剂的条件下反应，合成相应的生物柴油，但是此类方案依旧存在着对传统化学试剂的依赖性强，工艺复杂，对环境不友好和能耗大等诸多问题^[6]。

因此，研究人员开始尝试寻找一些反应条件温和，能耗低，经济环保的方案来制备生物柴油。生物酶法所制备的生物柴油大大降低传统柴油车的有机毒气体和一氧化碳和二氧化碳等温室气体的排放量，是一种可以替代传统化学法制备生物柴油的方案，因此逐渐引起了科研工作者们的关注，在未来的能源生产制备生物柴油的行业中有很大的发展前景。在众多合成生物柴油的方案中，采用脂肪酶催化法，是因为相较于其他种类的酶来说，对于温度和pH的要求较为苛刻，在实际生产过程中不能满足生产需要，因此选用脂肪酶作为酯催化的催化剂。采用简单的物理法（如直接混合法和微乳液法）也可以制备出相应的生物柴油，但是产物的化学性质不稳定，不利于实际应用^[7-9]。酯化法的反应原理主要是选用合适的催化剂，这里选用生物酶做催化剂在催化剂的作用下，醇与酯发生反应，生成一分子的水和酯，即引入一个酰基的过程。

图1 酯化反应示意图

本文尝试以油酸和甲醇为原料，采用脂肪酶催化法合成生物柴油，并就合成过程中的诸多影响因素进行探究。该方法可以在条件温和的实验条件下，利用少量的脂肪酶进行催化，得到酯化率较高的产物，为以后新型能源工业的开发提供了一个发展方向。

1 试验部分

1.1 实验试剂

酶：胰脂肪酶（来源于猪胰腺）（S1）、脂肪酶（来源于米曲酶）（S2）、固定化假丝酵母脂肪酶（S3）

化学试剂：油酸、石油醚、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、0.1mol/L氢氧化钠、酚酞指示剂

1.2 实验仪器

20 ml玻璃瓶、锥形瓶、铁架台、碱式滴定管、恒温水浴摇床、100 ml量筒、烧杯、玻璃棒、移液枪、超净工作台(SW-CJ-1D)、生化培养箱(LRH-70)、恒温振荡器(SHA-B/C)、分析天平(CPJ1003)、 恒温摇瓶柜(TS-1103C)、台式离心机(TG16-WS)、高效液相色谱仪(APSH-6510)。

1.3 滴定检测分析方法

将0.5 g左右的油样置于锥形瓶中，再加入5 mL 95 ％乙醇溶液，滴加2滴酚酞试剂作为指示剂，用0.1 mol/L的NaOH作为滴定剂，滴定至微红色即可^[10]。

酯化率=（V₀/W₀-V/W）/ V₀/W₀

字母	单位	含义
V0	mL	每次刚加入甲醇后所取的油样所消耗的NaOH的体积
V	mL	每次加入甲醇反应一段时间后所取油样消耗的NaOH的体积
W0	g	测V0时所取油样的重量
W	g	测V时所取油样的重量

2 结果与讨论

2.1 探究三种不同脂肪酶对催化酯化反应的影响

在四个20 mL的玻璃瓶中分别加入3.36 g油酸和0.68 mL甲醇，再加入有机溶剂5 mL石油醚，三种不同的0.05 g脂肪酶，另外一组空白对照。放入恒温水浴摇床时，需要测定初始酯化率，称取0.5 g油样分别置于四个50 mL锥形瓶中，然后加入5 mL乙醇，再滴加2滴酚酞作为指示剂，用0.1 mol/L的NaOH作为滴定剂，滴定至微红色即可。取完油样后将其继续放入恒温水浴摇床40℃密闭振荡反应。前12个小时每隔6小时取0.5 g左右，用NaOH 滴定测定酯化率。

按照上述步骤进行酯化反应速率的考察，结果如图2所示:

图2 三种不同脂肪酶以及空白对照对催化酯化反应的速率图

图2三种不同脂肪酶以及空白对照对催化酯化反应的速率图。从上图中可以清楚地看出，将三种不同的脂肪酶加入到相同的实验环境中，其对酯化率的影响差异还是较大的，相较于空白的对照实验数据而言，S1脂肪酶并未对甲酯化反应表现出催化活性，反而一定程度上抑制了反应的进行，S2脂肪酶对甲酯化反应表现出轻微催化活性，而S3脂肪酶表现出较为优异的催化活性，酯化率大幅度提升，说明S3脂肪酶对于该体系的酯化反应具有一定的促进作用，将其用来催化甲酯化反应合成生物柴油是可行的。

2.2 探究酯化时间对催化酯化反应的影响

为了探究时间对酯化反应效率的影响，进行了如下试验，分别在三个20 mL的玻璃瓶中分别加入3.36 g油酸和0.68 mL甲醇，加入5 mL石油醚作溶剂，加入0.05 g S3脂肪酶，在40℃的恒温水浴摇床中振荡反应。前24小时每隔6小时取0.5 g左右反应样品，用0.1 mol/L的NaOH作为滴定剂，滴定至微红色，记下所消耗的氢氧化钠的体积，计算出反应过一段时间体系中的酸值，与初始酸值相比较，计算出体系的酯化率。后每隔12小时测定酯化率。代入酯化率的公式计算出酯化率，从而推断出反应进行的程度。

图3 酯化时间对催化酯化反应的影响图

图3为酯化时间对催化酯化反应的影响图。如图3所示，当反应时间为0-24 h时，酯化率与反应时间呈正相关；24 h时，酯化率达到峰值，24 h-72 h，随着反应时间的增加，酯化率基本没有发生变化，甚至还发生了略微的降低，这是因为酯化反应是一个可逆反应，当达到平衡时，反应速率基本不会发生太大的改变，反而一味的延长反应时间会不利于反应的正向进行，反而会带来酯化率降低、能耗浪费和实验仪器的消耗等问题。因此，最适反应时间选择为24 h。

2.3 探究不同温度下对酯化反应的影响

在基本反应体系中，温度对酯化反应中酶的活性影响较大。本次试验在四个20 mL玻璃瓶中加入油酸和甲醇（摩尔比为1：1.5），加入5 mL石油醚，再加入0.05 gS3脂肪酶，分别在30 ℃、35 ℃、40 ℃和50 ℃的水浴恒温振荡器中放置四个玻璃瓶，进行密闭震荡，反应开始时需要取0.5 g左右油样，然后加入5 mL乙醇，再滴加2滴酚酞作为指示剂，用0.1 mol/L的NaOH作为滴定剂，滴定至微红色即可。并记下反应初始酸值，然后开始记时。反应一段时间后，分别测定他们的酯化率，探究这几种温度对酯化率的影响。

图4 不同温度下对酯化反应的影响图

图4为不同温度下对酯化反应的影响图。由上图可知，温度对酯化反应的影响还是较大的，在30 ℃下低酯化反应的速率低，因为温度低，酶的活性较低，但温度过高会导致酶失活和甲醇挥发，使酯化率降低，在50 ℃时酯化率大大降低，因为高温会导致酶的寿命缩短，适宜的温度才能有利于酶的活性。因此，必须找到合适的温度，从而使得甲醇化的酯化率最高，可以看出35 ℃时，酯化率相对较高，因此该酯化反应的温度控制在35 ℃时较为适宜^[11]。

2.4 探究反应介质溶剂对酯化反应的影响

为了探究有机溶剂对酯化反应速率的影响。本次实验选取了石油醚、丙酮、正己烷三种有机溶剂来进行探究。分别量取三份3.36 g油酸和0.68 mL甲醇，加入到三个20 mL的玻璃瓶中，分别加入5 mL石油醚、5 mL丙酮、5 mL正己烷，加入0.05 gS3脂肪酶，放入恒温水浴摇床40 ℃密闭振荡反应。反应之前取0.5 g左右油样，用NaOH测定初始酸值，反应进行一段时间后，测定计算反应体系中的酯化率。

表1 不同反应介质溶剂对酯化反应的影响表

溶剂	酯化率/%
石油醚		31.7
丙酮		31.6
正己烷		30.2

一般来说，酯化率在不同有机溶剂有所不同的主要原因有二^[12]：1、溶剂的疏水性；2、能否完全溶解底物。从一定程度上将分散液的疏水性能很大程度上影响酶的活性，而且研究表明疏水性能与酶表现活力成正比。但是对于该体系而言，作为反应原料之一的甲醇，有着极强的亲水性，大大减弱了溶剂极性对脂肪酶催化活性的影响，因此从上表中可以看出三种不同的溶剂对于酯化率的差异并不是太明显，但是考虑到丙酮具有一定的毒性，正己烷的价格较高，因此选择石油醚作为有机溶剂。

2.5 探究酸醇摩尔比对酯化反应的影响

对于一般的酯化反应而言应该是按照等摩尔比反应的，但是该比例也不一定就为最佳反应比，因而对于酸醇的比例也需进行优化。分别在其他变量不变的情况下，探究了1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3几种不同油酸与甲醇的摩尔比，并以此研究其对酯化反应的影响。

图5 不同酸醇摩尔比对酯化反应的影响图

从图5可知，油酸与甲醇的投料比为等摩尔比时，酯化率并未表现出峰值，而适量增加甲醇的含量时，酯化率有所提升，即在摩尔比为1:1.5时达到峰值，当再增加甲醇含量时，酯化率随即大幅度下降。究其原因，是因为大量过量的甲醇的存在，使得脂肪酶产生变质失活，从而不能达到催化的效果，因而酯化率有所下降^[13]。因此，控制好体系中甲醇的含量为关键，最佳油醇摩尔比为1:1.5。

2.6 探究甲醇的流加方式对酯化反应的影响

探究甲醇对脂肪酶反应速率的影响，采取了流加的方法，可以减少甲醇的毒性对试验的不利影响。在三个相同20 mL的玻璃瓶中，加入相同质量的反应物（3.36 g油酸，5 mL石油醚，0.05 g脂肪酶），然后1号瓶中一次性0.68ml甲醇，2号瓶中分两次加入甲醇溶液（先加入0.24 mL甲醇，6h后再加入0.44 mL甲醇），3号瓶中分三次加入甲醇溶液（先0.24 mL甲醇，6h后再加入0.24 mL甲醇，再过6 h后在3号瓶中加入0.2 mL甲醇），都保持在40 ℃恒温水浴摇床反应，总用时24 h。将总量为0.68 mL的甲醇溶液，分不同批次加入，探究甲醇加入批次对酯化过程的影响。

表2 甲醇的流加方式对酯化反应的影响表

编号	溶剂	酯化率/%
1号瓶	一次加入	25.6
2号瓶	两次加入	29.3
3号瓶	三次加入	31.2

探究甲醇加入批次对酯化过程的影响，表2可知，随着批次的增加，酯化率较高。由于过量甲醇能使体系中的酶失活，需要批量添加一定量的甲醇，但根据酶反应动力学^[14,15]，在反应开始时油酸的浓度相对较大，因此反应速率相对较快，消耗的甲醇就快，所以分批次数也不能太多，一般来说，三次较为适宜。

2.7 探究酶用量对酯化反应的影响

在其他条件不变的情况下，只改变酶油比进行探究酶用量（S3）对酯化反应的影响实验，分别选择2 %wt、3 %wt、4 %wt、5 %wt、6 %wt的酶油比进行酯化反应，研究了不同酶用量对酯化产率的影响。

图6 酶用量对酯化反应的影响图

在化学反应的进程中，催化剂的含量可以一定程度上提升产率，我们选用S3脂肪酶作为催化剂，图6为探究S3脂肪酶的含量对酯化率的影响，从图中分析可知，在起始阶段，酯化率随着脂肪酶催化剂的含量升高而升高，然后趋于稳定，这主要是因为随着脂肪酶含量的增多，会产生酶聚现象，不利于催化传质的进行，因此我们选用4 %wt最的脂肪酶的用量即可。

结 论

1. S3脂肪酶对于甲酯化反应具有一定的催化活性，可以选用其作为一种较为合适的催化剂合成生物柴油。

2. S3脂肪酶在24 h就可以将甲酯化反应催化完全，使得甲酯化的综合效率最高。

3. 温度对酯化反应有很大影响，酶活性在低温下较低，但高温会导致酶失活和甲醇挥发，酯化率降低。因此，酯化反应的温度控制更适合于35 ℃。

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