1. 研究目的与意义（文献综述）

银杏是我国古老的树种,是世界上最古老的珍稀树种之一。地球生命历经千亿年的变动，尤其是第四世纪冰川覆盖之后，只有银杏仍保持它最原始的面貌，在生物演化学史上被称为“活化石”。其叶、果实、种子均有较高的药用价值，其药理作用不断被认识，临床应用范围逐步扩大，具有很好的应用前景。银杏叶性甘，味苦、涩、平，归心、肺 经。有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛之功。中医主要用于治疗肺虚咳嗽、冠心病、心绞痛、高脂血症等。银杏叶提取物 ( ginkgo biloba extract， gbe) 是从银杏的干燥叶中提取的具有多种有效药用成分的混合物，是目前临床使用较广泛的中药材之一，药理研究结果显示，gbe中含有黄酮类、萜类内酯、有机酸、聚异戊烯醇类、甾体化合物、氨基酸、微量元素等在内的 100 多种化学成分。gbe 中最主要的活性成分为银杏黄酮和银杏内酯类化合物。虽然银杏作为药用至今已有600多年的历史,我们的祖先很早就将其用于人类防病治病和保健方面，然而真正对其进行药理及其他方面的研究始于70年代,近10多年来国内外的研究进展更为迅速。

随着现代科技的发展，药质量和安全问题直接关系到中医药的发展，越来越受到各界的广泛重视，因此科学、有效的质量标准则是保证其临床用药有效性、安全性和稳定性的关键准绳，且大多数是采用 hplc 方法建立的，分析时间较长、灵敏度较差、准确度 较低，不利于中药实现科学化、现代化和国际化的战略目标。质谱技术已经发展成为中药各类化学成分分析的一种重要手段高分辨质谱借助超高的分辨率，可以准确地测得杂质精确的质荷比，进而计算出杂质的元素组成，并能区分复杂背景中质量数接近的杂质及共流出组分，可以不经复杂的分离和纯化步骤即可获得样品的色谱和质谱信息，通过一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，推导其裂解规律，为解析化合物的结构提供直接证据，是一种可以针对目标或非目标药杂质研究的有力工具，在药物质量研究领域得到越来越多的应用。

目前，银杏中主要生物活性物质的测定方法主要有紫外可见分光光度法(uv)、气相色谱法(gc)、液相色谱法(lc)、气相色谱－质谱法(gc－ms)和液相色谱－串联质谱法等。紫外可见分光光度法操作简单，所需仪器易得，但准确性差，易产生假阳性; 气相色谱法具有较高的选择性，但操作步骤繁琐，样品需要衍生，分析时间较长; 液相色谱法需采用有机溶剂将待测物萃取后再进行分析，在某种程度上可以去除干扰组分，但操作耗时，无法满足痕量分析的要求。液相色谱－质谱法在食品检测中应用较普遍，已有文献报道利用超高效液相色谱－串联质谱建立了银杏中生物活性物质的测定方法，但将高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱用于银杏中不同部位的生物活性物质种类的比较测定尚未见报道。

2. 研究的基本内容与方案

本课题的研究（设计）的目标：

（1）探讨银杏叶、银杏果和银杏外种皮提取物中化学成分的不同，确定差异成分；

（2）探讨不同溶剂提取方法分别对银杏叶、银杏果和银杏外种皮提取物中化学成分的影响。

本课题的研究（设计）的基本内容：

（1）探讨同种溶剂提取对银杏叶、银杏果和银杏外种皮提取物中的化学成分的影响；

（2）探讨不同溶剂提取分别对相同物质提取物中的化学成分的影响；

（3）采用高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨率质谱对提取物进行成分分析。

拟采用的技术方案及措施：

（1）实验准备

1）银杏叶：采摘于武汉理工大学校区果园，晾晒一周，烘箱60℃ 15 min并用粉碎机粉碎，过60目筛，置于冰箱待用；银杏外种皮：采摘于武汉理工大学校区果园，采摘后去核，将其晒干并用粉碎机粉碎，过60目筛，置于冰箱待用；银杏果：采用上一步余下的果核，晾晒并于粉碎机粉碎，置于冰箱待用。

2）用去离子水、无水乙醇和无水丙酮于500ml容量瓶中分别配置75%的乙醇溶液和60%的丙酮溶液待用。

（2）银杏化学成分的提取

取待测样品倒入500mL三口烧瓶中,加入溶剂在一定料液比、温度和反应时间下搅拌提取，用双层滤布过滤（或滤纸抽滤），得到粗提取液。再按上述提取条件将剩余残渣重复提取。取一干燥的圆底烧瓶，将多次所得提取液合并至该瓶中，蒸干，得到样品。

加入的溶剂种类，提取温度，提取时间，提取次数如下表（不同组分别标记为：叶#1、叶#2、叶#3、果#1、果#2、果#3、皮#1、皮#2、皮#3）：

（3）银杏化学成分的检测

1）色谱条件：Thermo Scientific EASY-nLC 1000 C18色谱柱；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯 度洗脱，洗脱程序为 0～0.5 min，5%乙腈；0.5～2.0 min，5%～40%乙腈；2.0～5.0 min，40%～80%乙 腈；5.0～7.0 min，80%～100%乙腈；7.0～10.0 min， 100%乙腈；体积流量为 0.2 mL/min；进样量为 5 μL； 柱温为 40 ℃。

2）质谱条件：离子源为 HESI（heated ESI），辅助气体积流量 为 10 μL/min，辅助气温度为 300 ℃，离子传输管 温度为 320 ℃；正离子模式下：鞘气体积流量为 40 μL/min，喷雾电压为 3.50 kV；负离子模式下：鞘气 体积流量为 38 μL/min，喷雾电压为 2.80 kV，一级 质谱分辨率为 70 000，m/z 扫描范围为 80～1200。

3）供试品溶液的制备：

分别取取待测样，研细后取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯甲醇，密塞，称定质量，超声处理（功率 200 W，频 率 50 kHz）30min，放冷，再称定质量，用纯甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，续滤液用纯甲醇稀释 10倍，经0.22μm微孔滤膜滤过后，即得供试品溶液；

4）通过高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱对供试品溶液进行检测；

5）数据分析：利用高分辨率准确质量 (HRAM) 谱图库对谱图中所含成分进行分析比对。

3. 研究计划与安排

第1--3周：查阅相关文献资料，明确研究内容，了解研究所需药品、仪器。确定方案，完成开题报告；

第4—8周：完成银杏叶生物活性物质的提取、分离与纯化；

第9—11周：完成高分辨率质谱对提取物的检测；

4. 参考文献（12篇以上）

[1]朱俊峰. 基于化学生物学方法结合高分辨质谱技术的中药药效物质快速筛选方法研究[d]. 浙江大学, 2017.

[2]孙玉明, 王月月, 蔡蕊,等. 高效液相色谱-光电二极管阵列-高分辨质谱联用鉴定马鞭草提取物中的化学成分[j]. 色谱, 2017, 35(9):987-994.

[3]马悦, 赵乐凤, 吕子燕,等. 高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析桑葚中黄酮类和多酚类物质[j]. 质谱学报, 2017, 38(1):45-51.