摘 要

本文借助高分辨率四极杆串联轨道阱质谱，结合胰蛋白酶对糖基化肽的糖链结构进行了测定，得到了糖肽糖链的结构。然后又对银杏白果中的多糖的药用价值和消化吸收进行概括，并且对白果多糖进行了总糖测定和单糖组成测定，并且对白果多糖的提取、水解条件以及HPLC-ELSD测定条件进行了优化，结合总糖测定结果，确定了酸水解 HPLC-ELSD法测定白果多糖单糖组成的可靠性和实用性。

研究表明，利用高分辨率质谱得到了RNase B的糖基化糖链结构为高甘露糖型结构；白果多糖的最佳水解条件为：水解酸为：TFA，水解时间为:3 h ，最佳色谱检测条件为：流动相:乙腈:乙酸乙酯:水= 65：20：15，柱温：30 ℃，流速：0.8 mL/min 。

本文的特色：使用高分辨率质谱结合prospector、expasy、uniprot数据库和Glycoworkbench软件对RNase B的糖基化结构进行了测定，得到了其糖基化结构；利用HPLC-ELSD测定了白果多糖的单糖组成，确定了最佳测试条件，并结合多种方法对测定方法进行了评价；利用苯酚硫酸法测定了白果多糖总糖含量。

关键词：糖肽；高分辨率质谱；银杏白果多糖；单糖组成；药用价值；消化吸收；

Abstract

This article determined the structure of glycopeptide by high-resolution quadrupole orbital trap tandem mass spectrometry and trypsin. After, we got its exact structure. Then we summarized the medicinal value, digestion and absorption of ginkgo biloba polysaccharide. We also measure the structure of Ginkgo biloba polysaccharide by HPLC-ELSD and Phenol-sulfate method and optimized its extraction, hydrolysis and HPLC-ELSD determination conditions. We evaluated the reliability and practicality of the method by using multiple methods.

This research shows that using high-resolution quadrupole orbital trap tandem mass spectrometry, the structure of RNase B is multiple mannose structure. The optimized condition is Acetonitrile: Ethyl acetate:H₂O = 65：20：15, Column temperature:30 ℃，velocity:0.8 mL/min, hydrolysis time:3h, hydrolyzed acid: TFA.

Keywords：Glycopeptide; High-resolution mass spectrometry; Ginkgo biloba polysaccharide; Monosaccharide composition; Medicinal value; Digestion and absorption.

目 录

第 1 章 绪论 1

1.1 糖肽 1

1.1.1 糖肽的重要价值 1

1.1.2 糖肽的种类 2

1.1.3 糖肽的酶解 2

1.1.4 糖肽的前处理 3

1.1.5 糖肽的富集 4

1.1.6 糖肽酶解酶的特点比较 7

1.1.7 完整糖肽的质谱检测 8

1.1.8 糖肽质谱数据的分析 9

1.2 白果多糖 10

1.2.1 白果的中医药用价值 10

1.2.2 植物活性多糖的现代药用价值 10

1.2.3 多糖的消化吸收及药理作用 12

1.2.4 植物多糖的提取方法 16

1.2.5 植物多糖的纯化 17

1.2.6 植物多糖的结构测定 17

第 2 章 糖肽的结构测定 20

2.1 样品前处理 20

2.1.1 仪器 20

2.1.2 药品 20

2.1.3 步骤 20

2.2 酶解 20

2.2.1 仪器 20

2.2.2 药品 20

2.2.3 步骤 20

2.3 脱盐 21

2.3.1 仪器 21

2.3.2 药品 21

2.3.3 步骤 21

2.4 HILIC SPE糖肽富集 21

2.4.1 仪器 21

2.4.2 药品 21

2.4.3 步骤 22

2.5 质谱检测 22

2.5.1 仪器 22

2.5.2 质谱条件 22

2.5.3 测定方法 22

第 3 章 白果多糖的单糖组成和总糖测定 23

3.1 实验流程图 23

3.2 白果多糖的提取 23

3.2.1 仪器 23

3.2.2 药品 23

3.2.3 实验步骤 23

3.3 白果多糖的纯化 24

3.3.1 仪器 24

3.3.2 药品 24

3.3.3 步骤 24

3.4 白果多糖的测定 24

3.4.1 苯酚硫酸法测定总糖 24

3.4.2 HPLC-ELSD测定多糖的单糖组成 25

第 4 章 实验结果评价与展望 27

4.1 糖肽 27

4.1.1 一级质谱图匹配 27

4.1.2 二级质谱图匹配 27

4.2 白果多糖 30

4.2.1 提取结果 30

4.2.2 单糖组成 30

4.2.3 总糖含量 36

4.1 展望 37

参考文献 38

致谢 40

绪论

糖肽

糖肽的重要价值

蛋白质翻译后修饰中最常见、也是最重要的一种修饰是蛋白质的糖基化修饰。到目前已知的哺乳动物的蛋白质至少有一半是糖蛋白，广泛分布于各个组织细胞中，尤其是细胞膜表面、体液中含量丰富^[1]。糖基化的蛋白质有着诸多重要的作用，比如，利用异常的蛋白质糖基化修饰与各种疾病有关系这一特征，为医疗诊断提供有力途径；再如一些植物糖肽有一定的药用价值，具有降胆固醇、抗氧化、降血压、减肥、抗疲劳等作用。

医疗诊断

糖蛋白可用作医疗诊断是因为它作为肿瘤标志物，可用它来诊断肿瘤。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）具有这种性质，所以可以作为临床诊断的糖蛋白。肝癌患者通常会出现其甲胎蛋白糖链上的核心岩藻糖含量比与正常人显著增加的现象，因此通过对其含量变化的检测，来诊断病人是否患有肝癌。具有类似性质的糖蛋白还有前列腺特异性抗原（用于前列腺癌诊断）、癌抗原19-9（用于胰腺癌监测）、（用于乳腺癌监测）、癌抗原27-29和人类表皮生长因子受体2（HER-2）等。

吴丽芳等^[2]通过对36例慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）患者和16例健康对照者进行研究发现血清羟基端糖肽可作为治疗效果的判断依据，以此来确定慢性阻塞性肺疾病极性加重期患者治疗情况，给医生以指导作用。

药用

张雪梅等^[3]使用大豆糖蛋白为底物通过酶解法处理后，制备得到了大豆糖肽，并用此大豆糖肽对小鼠脾细胞进行培养，研究大豆糖蛋白对其增殖有影响，进一步研究发现大豆糖肽对免疫功能有双向调节的作用。

孙钰等^[4]通过研究发现角质细胞形成是银屑病的主要发病机制，使用薄芝糖肽进行实验，发现薄芝糖肽可以以角质形成细胞作为的靶细胞，特异性的与多种免疫相关细胞、细胞因子及炎症介质等所引起的角质形成细胞增生过快起到阻断的抑制作用，阻碍其主动参与皮损内的T细胞的再活化或通过调控其它免疫细胞发生异常，以此来达到平衡银屑病的免疫紊乱性发病及病理过程的目的。

李进等^[5]利用云芝糖肽（PSP）对进行动物实验，通过研究发现云芝糖肽的药用机理是通过增强EAC（艾氏腹水癌）实体型荷瘤小鼠的免疫功能，从而间接的发挥其抗肿瘤的作用；另外研究者还发现PSP另外的作用机制是通过调控瘤细胞的细胞周期蛋白CDK4和改变凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值，以此来直接抑制瘤细胞的生长；同时经过研究，研究者还发现Tan IIA（丹参酮IIA）只对荷瘤小鼠的淋巴细胞比值有一定影响，若和PSP联合施药，则可对实验动物的淋巴细胞功能进行改善，从而进一步增强PSP对免疫系统的调节用和其对肿瘤的抑制作用。

糖肽的种类

N-糖基化糖肽

这一类糖蛋白通常是指在氮末端氨基酸处与糖链形成糖苷键连接点而得到的物质。由于大多数此类糖蛋白的糖链与天冬氨酸（Asn）的氨基侧链是由共价键所连接，所以此类糖蛋白都拥有一个共同的核心，即它们都含有三个甘露糖和两个氮乙酰葡糖胺。根据其所含糖链的不同，该类糖蛋白又可分为高甘露糖型，复合型以及杂合型。其中高甘露糖型主要由氮乙酰葡糖胺以及甘露糖组成。复合型糖肽则除了这两种糖以外，还含有其他单糖，如果糖，半乳糖，唾液酸。杂合型则包含了高甘露糖型以及复合型的特征^[6]。

O-糖基化糖肽

这一类糖肽的特点是乙酰葡糖胺同蛋白质序列中的丝氨酸或苏氨酸上的羟基形成糖苷键，以此来形成糖肽。但是也存在除此之外的其他类型的连接，所以导致该种糖肽存在多种类型。

C-糖基化糖肽

此类糖肽是由其糖链与蛋白残基侧链吲哚环上的碳原子（C-2）形成C-C单键相连形成。此类糖基化较为罕见，目前仅在为数不多的天然产物中发现^[7]。

糖基磷脂酰肌醇锚（GPI-Anchor）糖基化糖肽

这类糖蛋白通过末端与细胞膜上的糖基化磷脂酰肌醇相连，将蛋白固定于细胞膜表面，而不跨越其磷脂膜双层^[7]。细胞膜的诸多功能，如细胞信号跨膜传导等，都与之有关。

糖肽的酶解

含有6~20个氨基酸残基的多肽最适宜质谱分析，而蛋白酶的作用是将蛋白酶切为适宜质谱分析的多肽^[7]。胰蛋白酶蛋白质组学研究中广泛使用的一种蛋白酶。该酶的作用原理是特异性地水解碱性氨基酸残基Arg和Lys的C-端肽键，将蛋白质高分子酶解为大小合适的多肽段。但使用蛋白酶酶切时应注意区分，以免生成过长或者过短的肽链影响测定结果。目前用于蛋白质酶切的酶有trypsin、chymotrypsin、Glu-C等。

而糖链酶切则主要依赖于肽-N-糖苷酶（peptide-N-glycosidase，PNGase）和糖苷酶（glycosidase）^[7]。P其作用原理如图所示。

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