摘 要

泛素这种小分子蛋白质对于维持机体的正常生命活动，保持细胞内的稳态具有重要意义。它作为信使分子在细胞内传递信息，调控相关的生理活动进程启动、进行以及结束，参与蛋白质降解、损伤DNA的修复、膜运输等过程。它可以对蛋白质分子进行多种多样的翻译后修饰， 单分子修饰或是以泛素链进行修饰，此外泛素分子表面存在着不同的连接位点，可以形成多种不同连接类型的泛素链，这些不同的修饰方式也对应着不同的生理功能。本论文对泛素的典型降解功能与非降解功能对应的K48和K63连接方式进行了回顾，简单介绍了泛素分子的构成以及空间结构，提及了泛素相关的研究。接下来，介绍了蛋白质纯化的方法和不同方法纯化所利用的原理。主要介绍了膜分离、沉淀分离、电泳分离、色谱分离这几种蛋白纯化方法，着重介绍应用广泛的色谱分离方法。最后描述了近期所进行工作，介绍了蛋白制备的一般流程，包括质粒转化、单克隆、扩大培养以及收菌破胞纯化。

关键词：泛素；泛素的生理功能；蛋白质纯化；分离技术；

Abstract

Ubiquitin, a small-molecule protein, plays an important role in maintaining the body's normal life activities and maintaining its homeostasis. As a messenger, it transmits information in cells, regulates the initiation, progression, and termination of related physiological processes, and participates in processes such as protein degradation, damaged DNA repair, and membrane transport. It can carry out a variety of post-translational modifications of protein molecules, single-molecule modification or ubiquitin chain modification, in addition there are different attachment sites on the surface of ubiquitin molecules, can form a variety of different types of connection ubiquitin chain These different modifications also correspond to different physiological functions. In this thesis, we review the connection between K48 and K63 which are typical degradation functions of ubiquitin and non-degradation functions, briefly introduce the composition and spatial structure of ubiquitin molecules, and mention ubiquitin-related studies. Next, the method of protein purification and the principles used for the purification of different methods are described. Mainly introduced the membrane separation, precipitation separation, electrophoresis separation, chromatographic separation of these protein purification methods, focusing on the application of a wide range of chromatographic separation methods. In the end, the recent work was described and the general procedures for protein preparation were described, including plasmid transformation, monoclonalization, expansion culture, and purification.

Key Words：Ubiquitin; Physiological function of ubiquitin; Protein purification; Separation technology;

目录

第1章 绪论 1

1.1 泛素简介 2

1.1.1泛素的发现 3

1.1.2泛素结构 3

1.2 泛素与生理活动 5

1.2.1 泛素化与去泛素化 6

1.2.2泛素-蛋白酶体通路 7

1.2.3泛素介导非降解通路 8

1.3 蛋白质纯化 8

1.3.1 膜分离 8

1.3.2 沉淀分离 9

1.3.3 电泳分离 9

1.3.4 层析分离 9

1.4 主要目的内容与意义 11

第2章 实验部分 12

2.1实验方案 12

2.2 实验内容 12

2.2.1质粒转化 12

2.2.2 涂平板 13

2.2.3 单克隆 13

2.2.4 收菌及破胞 14

2.2.5 蛋白纯化 14

第3章 结果与讨论 16

3.1 质粒转化 16

3.2 蛋白表达 17

3.3 蛋白纯化 17

3.4 质谱分析 19

第4章 总结展望 21

4.1实验总结 21

4.2 展望 22

参考文献 23

致 谢 25

第1章 绪论

生命科学的起源，往前追溯可以上溯至两千多年以前。毫不夸张地说，从人类这一物种诞生之日起，生命科学也就产生了。不论是匠人、弗洛勒斯人、尼安德特人或是智人，他们都需要生存，而无一例外，任何生物的生存都需要为生命活动提供能量。生活在狩猎采集时期的人类需要寻找、采集植物以及猎捕飞禽走兽，由这些获得的动、植物来提供人类生命活动所必需的能量。在这一过程中，不管是有意或是无心，人类必然会有经验的积累，例如，观察到春天（当时的人可能没有“春天”的概念，但是应该能够感受到季节变化时的温度改变等特征）迎春、桃树、李树等各种植物竞相盛开色彩缤纷姿态各异的鲜花，而等到了秋天各种植物都结出了各色丰硕的果实，一部分好奇的人将这些果实一种一种放到嘴里尝一尝（这也算是“实验”了），发现这些果实有的酸，有的甜，有的涩，有的水分充足，口感细腻，另一部分则如同枯木，味同嚼蜡。这样人类就知道了应该在温度舒适宜人、周围的田野里各种植物发出新绿的时候不去破坏甚或应该保护某些植物开放的花朵，因为这些花朵会在一段时间后变成可以提供能量的食物。这是基础的宏观的生命活动的规律，正是对这些规律的了解运用才保障了人类的生存。

生命科学发展至今为人类社会的发展做出了重要贡献，深刻地改变了我们的生活方式，从纺织衣物的天然纤维到香喷喷的米饭再到医疗卫生，都与生命科学有着紧密联系。^[1]甚至，现在炙手可热的人工智能也与生命科学有着千丝万缕的联系，模仿神经元连接而搭建的卷积神经网络在AI领域仍发挥着重要作用。时间再往前四十年，也就是1978年，美国生物化学家J.Mcalear就率先提出利用蛋白质制作元件来组装生物芯片。^[2]与传统的硅芯片相比，生物芯片能量利用率高，发热量极低，在含有一定量的门电路的条件下，其体积却只有无极芯片的十万分之一。生命科学的发展由早期的经验发展到实证的科学，由宏观层面发展到微观层面。1866年，Mendel所发表的《植物杂交试验》一文为现代遗传学奠定了基础。1900年，Mendel遗传定律的再发现使得遗传学基本定律得到了认可。由Watson和Crick发现DNA双螺旋结构开始，我们进入到今天的分子生物学。^[3]

分子生物学时代早期，人们最感兴趣的研究对象就是遗传物质—DNA，通过肺炎双球菌转化实验，我们证实了蛋白质并非遗传物质，脱氧核糖核苷酸才是真正的遗传物质。经过长期的不懈努力，我们掌握了生物体内遗传信息传递的中心法则，破译了遗传密码子。而这些都成为进一步研究的基石。

在生物体内，除了遗传物质外，另一类功能庞大而且数量繁多的物质就是蛋白质。蛋白质是生命活动的物质载体。蛋白质既能构成有机体的组织，塑造形体，也能作为高效催化剂参与生命体内一系列化学反应，储存能量、释放热量、消解食物等等。蛋白质作为生命体内生理功能的执行者，参与了生命体遗传、生长、发育的全部过程。生物体内有成千上万种结构的蛋白质，与之相应就对应着成千上万种不同的生理功能。从宏观到微观的认识，我们已经在蛋白质的研究之路上走了一百八十年了，却仍然还只是对它有一个肤浅的认识。^[4]为什么是这个蛋白质？为什么是这个功能？它是如何发挥这个功能的呢？我们无法详尽回答。目前对于蛋白质的研究仍在深入。

对于蛋白质功能的关注一个重要因素是由于其与人类健康的紧密联系，已知的遗传性疾病大部分是由于基因突变导致的对应蛋白质的异常而引起，典型的有苯丙酮尿症、白化病、囊性纤维化等。^[4]清楚地认识蛋白质的工作机制将有助于我们针对正常工作机制中的异常环节进行调控，找到药物作用的靶标。在近四十多年的研究中泛素这一小分子蛋白颇受关注，它在标记将要降解的蛋白、DNA损伤应答、基因转录调控、细胞周期调控等信号转导活动中承担重要角色。

泛素蛋白严格说来并不是蛋白质，而是一种多肽。泛素（Ubiquitin,Ub）由76个氨基酸通过肽键连接而成，单个泛素或者是泛素链能够共价连接至底物蛋白质上，完成翻译后修饰。^[5]泛素的翻译后修饰介导的信号通路涉及生物体内各方面生理功能的正常进行，而且其调控机制构成一个复杂网络^[6]，清晰展现其调控网络需要大量研究。而最基础的就是获取足够的样品，本文也主要聚焦样品的制备。

1.1 泛素简介