文献综述

生命科学的飞速发展离不开新技术新方法的应用。目前人们对于细胞内外物质分析和检测以及疾病早期诊断有着浓厚的兴趣,许多研究人员一直致力于新分析技术的研究和开发。荧光标记作为一种非放射性的生物标记技术受到广泛重视,并取得迅速发展。目前用作发光标记物主要有 3 类材料:有机荧光材料、半导体量子点及稀土上转换发光纳米材料 (UCNP s)。其中,UCNP s是一种通过镧系掺杂将近红外光转化成可见光的发光纳米材料^{[ 1]}

相对于有机染料和量子点而言,UCNP s作为新一代生物发光标记拥有许多优点,例如毒性小、化学稳定性高、光稳定性好、吸收和发射带很窄、寿命长。另外近红外激光作为其激发源也带来了许多优势,例如较深的光穿透深度、对生物组织几乎无损伤、 生物组织不会发光(无背景荧光) 等; 这些特征导致它们拥有广阔的、光明的生物应用前景。UCNP s 用于生物发光标记的前提是: sup1; 其尺寸较小并形貌可控;ordm; 发 光 效 率 较 高; raquo; 表面有活性基团( 如) COOH、) N H ₂ 或者)SH) ,具有水溶性。然而,尽管 UC NP s的制备己有多年的研究历史,并取得了一些重要的研究成果; 但是相对于有机染料和量子点而言,它们在生物标记方面的应用研究还是较少的,目前还处于研究的初步阶段。本文介绍了UCNP s制备方法、表面修饰及其生物应用的最新进展。

稀土上转换发光材料（up conversion nano particles，UCNP s）是指材料吸收能量较低的光子时却能够发出较高能量的光子的材料，或者也可以说是受到某种光激发时，材料可以发射比激发光波长短的荧光材料。本质：反Stokes发光。

1959年，用960nm的红外光激发多晶ZnS,观察到525nm的绿色发光。

1962年，此种现象又在硒化物中得到了进一步的证实。

1966年， 法国科学家Auzel在研究钨酸镱钠玻璃时，意外发现，当基质材料中掺入Yb3 离子时，Er 3 、 Ho3 和 Tm3 离子在红外光激发时，可见发光几乎提高了两个数量级，由此正式提出了”上转换发光”的概念。

20世纪 90年代初：在低温下(液氮温度)

在掺Er3 ：CaF2晶体中上转换发光效率高达25%。

在室温下，在氧化物等晶体中也成功地获得了激光运转，上转换发光效率超过了1％，高达1.4％。

近几年来，纳米材料的小尺寸效应、高比表面效应、量子效应等优点使纳米材料成为稀土离子上转换发光领域中一个新的研究热点，尤其是镧系掺杂发光材料的研究最多 。

上转换发光材料的组成：NaYF4: Yb3 ，Er3 纳米颗粒

最有效的基质材料：NaYF4

常用的敏化剂为：Yb3

激活剂通常是：Er3 、Ho3、Tm3 等。

UCNP s的激发光源：近红外连续激光器（980 nm）

2 ． 表面修饰

虽然UCNP s的制备方法很多,但是所获得的UCNP s的表面通常为疏水的有机配体(例如油酸),长的烷基链指向外层,导致它们不能溶于水,也难以与生物分子连接。所以,应该发展一些表面修饰的方法来将疏水的 UCNP转化成水溶性的、表面含有活性基团(例如) CO OH、) NH2或者)SH)UCNP s目前常用的表面修饰方法主要有5种:SiO2包裹法、配体交换法、聚合物包覆法、静电层层自组装法和配体氧化法。SiO2包裹法是采用SiO2包裹UC NPs ,这种方法比较成熟, 应用广泛。新加坡国立大学的Zhang等^{[ 15- 1 7 ]}较早开展这方面的工作,成功地制备了SiO2包裹的UCNP s(B-NaYF4BYb,Er/Tm) , UCNP s尺寸分布均匀, 颗粒间没有团聚现象,基本上每个 S i O2壳内只有一个纳米颗粒。这种方法对工艺的要求较高,难以精确控制包裹层的厚度或者形貌。配体交换法是通过配体交换的方式制备亲水性的 UCNP s ,这类方法主要 采用配位能力较强、多功能的有机配体来取代 UC NPs表面配位能力较弱、疏水的有机配体。Chow课题组[ 9]利用两端为羧酸的聚乙二醇取代 UCNP s表面的油胺配体,制备了亲水性的、羧酸功能化的UCNP s ,配体上自由的羧酸可用于连接生物分子。但是这种方法的交换效率很难确定。

聚合物包覆法是利用两亲性的聚合物疏水端和UCNP s表面的疏水配体之间的范德华力, 再加上亲水端的亲水作用,形成一个疏水/亲水的有机核-壳结构。这样既解决了水溶性和官能团的问题,又可以减弱水对UCNP s的荧光淬灭效应。例如,Chow课题组^{[ 1 8 ]}将商用的聚丙烯酸经过25%的辛胺40%的异丙胺改性后,包覆在疏水的UCNP s表面,制备了具有疏水/亲水的有机核-壳结构的UCNP s。这种方法工艺相对比较复杂。静电层层自组装法首先在疏水的UCNP s表面吸附一层带电的聚合物,然后再将其加入带异种电荷的聚合物溶液,这样2类聚合物因带有异种电荷就互相吸引。如此依次吸附,2种聚合物就可以在UCNP s的表面交替组装成有机壳层。通过改变吸附层数可以调控有机壳层厚度,从而优化 UC NPs在水溶液中的稳定性和生物体内兼容性。李亚栋教授课题组^{[ 19 ]}先在UCNP s表面吸附一层带有铵基盐酸盐基团的 P A H, 然后将其加入带有磺酸钠基团的PSS聚合物溶液,由

于铵根离子带正电,磺酸根离子带负电荷,2种高聚物通过静电作用相互吸引。这种方法操作步骤繁琐,不易控制。

配体氧化法是笔者课题组发展的一种新型表面修饰方法^{[ 20 ]}。笔者利用Lemieux-vonRud loff试剂( KMnO4 NaIO4水溶液) 将UCNP s表面的油酸配体氧化成壬二酸配体,就可得到亲水性的、羧酸功能化的UCNP s ,如图1所示。氧化过程对 UCNP s的形貌、晶相、组成和发光性能没有明显的负面 作用。FTIR和NMR测试结果表明,UCNP s表面产生了大量羧酸基团。羧酸基团的存在不仅使 UC NP s具有良好的水溶性,而且可以和许多生物分子例如链亲合素直接偶联。这种方法适用于本身不会被氧化、但是表面配体含有碳碳不饱和键的纳米材料, 例如表面有油酸或者亚油酸的稀土纳米材料。

3 . 生物应用

早期的研究中,人们将大颗粒的(几百纳米)稀土上转换发光材料用于免疫组化人绒毛膜促性激素的免疫层析图谱分析和用于体外核酸分析^{[ 21- 23 ]}。随后,Lim等将150nm的稀土上转换发光材料用于线虫的培养,并对线虫的肠做了扫描电镜成像分析^{[ 24]}。但是值得说明的是,这些稀土发光材料的尺寸比较大,没有合适的表面官能团, 导致它们并不太适合用于细胞和动物成像。近5年,人们合成了一些尺寸较小、形貌可控的UCNP s ,初步研究了它们的生物应用,包括DNA传感以及细胞和老鼠成像等。下面主要介绍笔者课题组在 DNA纳米传感器、生物成像以及生物系统发电机这3类UCNP s应用方面的研究进展。

3.1 DNA 纳米传感器

笔者课题组通过形成酰胺键将链亲合素(strep2tavidin)连接在羧酸功能化的UC NPs (成分为NaYF4BYb,E r)表面,再利用这种UCNP s构建了一种高度灵敏的DNA 纳米传感器^{[ 20]}。这种 DNA纳米传感器的设计原理见图2,利用2个短的DNA序列来捕捉一个长的目标DNA序列。2个短的DNA序列中,一个为含有生物素( biotin )的捕捉DNA序列,它通过生物素与链亲合素之间的特异性作用而连接在链亲合素功能化的UCNPs上;另一个为含有染料TAMRA的报告DNA序列,染料TAMRA的吸收谱与UCNP s的发射谱中绿色带重叠,其发射峰大约位于580nm处。

在streptavidin功能化的UCNP s、捕捉DNA和报告DNA的混合物溶液中,当采用980 n m 连续激光器作为激发源时,仅能观察到UCNP s的发光信号,说明了UCNP s与报告D NA之间的距离较远,不能发生有效的荧光共振能量转移。当在以上混合物溶液中缓慢加入目标D NA 后, 同样以 9 80 n m 连续激光器作为激发源, 可以观察到一个位于约 58 0 n m处的宽

发射峰逐渐出现,对应于TAMR A 的发射,同时UCNP s的绿色发射峰强度逐渐下降。以上现象说明发生了有效的荧光共振能量转移,这是因为DNA之间的组装促使了UCNP s (能量给体)与 TAMRA(能量受体)之 间接近, 由于TA MR A的吸收谱与UCNP s的发射谱中绿色带重叠, UCNP s的绿色发射能量就会被 TAMRA吸收, 随后TAMRA发光( 约580 n m 处的宽发射峰)。另外发现在测量的浓度范围 (10~ 50nm) 内,目标 D NA 的浓度与发光峰的强度比 ( I580/I540或者I540/I654)存在线性关系,由于这里测量的目标DNA 浓度极低, 说明了这个DNA 传感器拥有极高的灵敏度。这么高的灵敏度应该归因于在 980 n m激光器激发下,没有任何背景荧光,仅有UCNP s能够发光。

3.2 生物成像

笔者课题组首先将叶酸( FA)连接在一种表面有胺基的UCNP s上,随后将2种癌细胞分别放在含67Lg/mL UCNP s-FA的培养液中37e孵育1h ,这2种癌细胞是叶酸受体表达阳性 F R( )的宫颈癌( He La)细胞及叶酸受体表达阴性FR(-)的人乳腺癌(MCF-7)细胞^{[ 25]}。当使用980n m连续激光作为激发源时,可以观察到来自He La细胞区域的绿色和红色发光, 光谱扫描分析表明这种发光来源于UCNP s的发光。H La细胞的明场照片能与荧光照片很好地重叠在一起,UCNP s主要分布在细胞膜区域。这是因为He La细胞与UCNP s表面的叶酸具有强特异性作用。相反,同样条件孵育的MCF- 7细胞呈现极弱的荧光,这是因为MCF - 7 细 胞与UC2NPs表面的叶酸具有很弱的相互作用,因此只有极少量的 UC NP s吸附在表面。值得注意的是,当用980 nm 激光激发He La细胞时,仅观察到UCNP s的发光,并没有收集到生物样品自发荧光。UCNP s的上转换发光信号强度大于4095 ,但是细胞核区的发光趋近于0。这是因为生物组织在980n m处的吸收极小,不会通过近红外光激发产生荧光发射。因此,采用UCNP s作为发光标记能完全消除生物体系自发荧光的干扰, 同时也能避免其他染料的串色, 拥有极高的灵敏度。

3.3 生物系统发电机

用于激发UCNP s的近红外光(例如980 nm 激光)具有较好的生物穿透性,对生物组织没有破坏作用, 因此进入生物体内的近红外光作为一种驱动能源拥有非常光明的发电前景。笔者在传统的染料敏化纳米晶太阳能电池内引入UCN s(Na(Y115 Na 015 ) F6 BYb , Er纳米棒)薄膜, 组装了一种980 nm激光驱动的纳米发电机(980LDG),如图3所示^{[ 26]}。在功率为1W的980nm激光激发下,电池内部的UCNP s薄膜吸收980nm激光并发射出可见光;可见光再被染料吸收, 处于激发态的染料将电子注入TiO2 导带从而导致电荷分离。该电池产生

的开路电压为0160V,短路电流为1150 mA ,最大输出功率为0147mW。重要的是,在1~ 6 mm 厚的生物组织覆盖下,该980 LDG的最大输出功率依然能够达到0128 ~0102m W,足够驱动许多纳米生物器件。因而这类98 0 L DG具有为纳 米生物器件供电的光明应用前景。

4.稀土纳米发光材料的前景与展望

随着纳米材料制备技术的不断发展和完善，人们已经用许多不同的物理方法和化学方法制备出不同尺寸,不同结构和不同组成的纳米发光材料，并对其发光特性进行了研究。由于各种技术各有优缺点，将各种技术扬长避短也将是合成纳米稀土发光材料的发展趋势。

其次，在发光激励的研究方面，寻找出粒径，表面形态及微观结构等的变化与材料性能之间的关系。通过纳米稀土发光材料的制备技术，对纳米微粒的粒径进行控制，制备出一系列不同粒径的纳米微粒，从而进一步研究纳米稀土发光材料的发射波长，发光率以及猝灭浓度等性能与纳米微粒的粒径变化之间的关系。

总之，稀土掺杂纳米发光材料独特的性质使其具有广阔的应用前景，如果能够将其实用化，必将对人类社会产生深远的积极影响

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