1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

摘要：综述了固相多肽合成中聚合物载体和连接分子、保护基选择、接肽反应方法、去保护的过程及固相合成所存在的问题。多肽的合成不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。特别是固相多肽合成方法的创立和发展。

关键词：多肽固相合成；氨基酸的保护；接肽。

多肽是α- 氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。多肽一般指由低于五十个氨基酸组成的化合物，它们的分子量低于10000Da（Dalton道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。高于五十个氨基酸以上的化合物通常称为蛋白质。每一种多肽都具有独特的组成结构，不同多肽的组成结构决定了其功能。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，其在生物体内的含量很低，但却具有显著的生理活性。

人们获得多肽的来源^[1]有：① 存在于生物体中的各类天然活性肽；② 消化过程中产生或体外水解蛋白质产生；③ 通过化学方法（液相或固定相）、酶法、重组 DNA 技术合成。目前酶法合成只局限于短肽的合成，而重组 DNA 技术则能合成大分子肽，但需要一个长期的研究与开发阶段。固相合成法则是用来合成中等链长多肽的主要方法。固相合成法在 20 世纪 60 年代才出现，Merrifield ^[2] 创立并发展了固相多肽合成的方法，具有里程碑的意义，对化学、生化、医药、免疫及分子微生物等领域都有巨大的推动作用。

1、多肽固相合成概述

1.1 多肽合成基本原理

化学多肽合成是按照设计的氨基酸顺序，通过定向形成酰胺键方法得到目标分子。从理论上讲这并不复杂，但实施起来却非常困难。简单的羧酸与胺之间形成酰胺键，一般是先将羧基转变成一个活泼的羧基衍生物（如酰氯或酸酐）再与胺作用，或者在反应体系中加入缩合剂。氨基酸之间形成酰胺键情况则复杂得多，每一个氨基酸既含有氨基，同时又含有羧基。如果将一种氨基酸的羧基活化，则其可以和同一种或另一种氨基酸分子的氨基反应；如果将几种氨基酸混合在一起，加入缩合剂，则会得到由具有多种不同氨基酸顺序的多肽组成的混合物。随着肽链的增长，副产物更多，合成将更困难。

Merrifield 创建并发展了多肽的固相合成方法之后，多肽研究领域发生了划时代的变化。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性^[3]，与传统的液相合成法相比，固相载体有利于合成中不断增长的肽链固定、环化、去保护和纯化，且易实现自动化。然而，由于设备和试剂的昂贵严重限制了固定相合成法在规模化生产上应用。目前主要在合成含有 10~100 个残基的多肽或为筛选而快速建立多肽库时应用。

固相合成的主要设计思想是^[4]：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上，氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基，并同过量的活化羟基组分反应接长肽链。重复缩合－洗涤－去保护－中和和洗涤－下一轮缩合的操作，最终达到所要合成的肽链长度；最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

其基本原理如下图所示：

图1 多肽固相合成原理

在宏观合成过程中，每连上一个氨基酸可以通过茚三酮显色反应检测连接完成度，其反应原理是：前一氨基酸脱保护后N端处于裸露状态，可被茚三酮染上颜色，连接下一Fmoc保护氨基酸后，原本裸露的N端形成肽键，处于闭合状态，因此茚三酮染不上颜色，但是如果前一氨基酸脱保护不完全的话同样检不出颜色，从而造成反应已完全的误解。为了使检测更准确，最好的办法是采用量化检测法^[5]即在氨基酸连接过程中检测树脂替代度。

显然，用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满足三个条件：一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上，然后从氨基端逐步增长肽链^[6]； 二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去；三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化。

1.2 多肽固相合成两种常用方法的比较

氨基酸在进入目的肽之前，氨基端需要保护基。根据保护基的不同，多肽固相合成方法可以分为两大类： Boc 方法和 Fmoc 方法。这两种方法的合成原理基本相同，但由于保护基有差异，后面所应用的一系列试剂、条件等都发生了相应的改变。

（1）Boc（叔丁氧羰基）多肽固相合成法

Boc 方法是经典的多肽固相合成法， B Merrifield 在合成血管舒缓激肽时，就是应用 Boc 作为α- 氨基酸的保护基。Boc 方法反应条件剧烈而且危险，现在其使用率不高。虽然 Boc 方法正逐渐被 Fmoc 方法所替代，但其有些方面还是值得我们借鉴和应用。如澳大利亚科学家 LMiranda ^[7] 等在利用”化学选择连接” 法合成蛋白质时，选择 Boc 方法合成组成蛋白质的各个片段。与 Fmoc 方法相比，他们认为 Boc 方法更干净、更可靠、更能快速去除α- 氨基保护基。Fmoc 方法则过度依赖于肽序列，并且不能完全去除α- 氨基的保护基。

（2）Fmoc（9 - 芴甲氧羰基）多肽固相合成法

Fmoc 固相合成是以 Fmoc 为保护基保护α- 氨基酸，逐步完成接肽反应的一种多肽固相合成的新方法。由于 Fmoc 对酸稳定，易与碱作用，所以应用碱性化合物作脱保护剂，具有反应条件温和、副反应少、产率高等优点^[9] 。同时 Fmoc 基团有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行^{[8, 10]}，因此 Fmoc 固相合成法已经被广泛采用。

表1 Boc 固相合成和Fmoc 固相合成的区别

	Boc 固相合成	Fmoc 固相合成
树脂类型	聚苯乙烯等	聚苯乙烯,聚酰胺等
反应基团的导入	形成苯酯或甲基二苯甲基胺	聚烷氧苯基酯,烷氧苄基胺
N2保护基	Boc2	Fmoc2
侧链保护基	Boc，tBu , OtBu，Bzl，Tos 等	tBu ,OtBu ,Trt ,Pbf 等
N2保护试剂	TFA/ CH2Cl2	六氢吡啶
偶联试剂	碳二亚氨等	HATU ,HBTU ,TBTU 等
肽链切落试剂	HF	TFA
切落过程清除剂	苯甲醚	硫醇,硅烷,水等

2、聚合物载体和连接分子

固相合成中采用的载体由两个部分组成：一部分是高分子树脂，另一部分是连接分子。这是区分固相合成与传统液相合成的一个重要特征，用于固相合成多肽的载体应是惰性的、不溶性的交联聚合物，载体上有足够的反应位点，使氨基酸以共价键的形式连在这些位点上，并在合成反应结束后，这种共价键能被裂解；空间位阻要小，便于溶剂的渗透，允许肽链增长不受空间阻碍，并能够对单体中活性基团进行选择性保护和去保护；连接反应物到载体上的方法应便于在合成过程中分析反应过程且最后给出目标物时，可以选择性地从载体上裂解下一部分或全部产物。所以正确的选择树脂与连接分子决定了固相合成的效率^[11]。在大多数固相合成多肽中，溶胀型树脂均优于非溶胀型树脂。在固相合成中，连接分子发挥着重要作用，它决定着从固相载体上把产物裂解下来的方法以及产物末端所暴露出来的功能团^[12]。假如与树脂相连的肽的末端氨基酸为酰胺类型,可选用 Wang 法制备的对苄氧苯甲醇（HMP）树脂^[13]。

3、多肽固相合成中氨基酸的保护

多肽固相合成要求接肽反应中不参与酰胺键形成的活泼基团要受到保护，同时反应结束后这些保护基团能脱除。常用的固相合成法，肽链的 α- 羧基端是固定在载体上进行保护。保护基的选择决定了产物的得率与纯度，脱保护试剂的选择，侧键活泼基团的保护，切割试剂的选择等等。固相合成中没有通用的保护策略，需根据合成肽的性质来选择保护基。氨基酸的保护可分为 α- 氨基保护和侧链保护。

3.1 α- 氨基保护基的选择

氨基是亲核性很强的基团。氨基经酰化后，亲核性消失，因此对游离氨基实施酰化是保护氨基的基本方法。但是考虑到肽键形成后，应能在温和条件下将保护基除去，因此对氨基保护基有特殊要求。

氨基保护基有9-芴甲氧羰基（Fmoc），叔丁氧羰基（tert-butoxycarbonyl group，简称 t-Boc），苄氧羰基（carbobenzoxy group，简称 CBz），对甲苯磺酰基（p-toluenesulfonyl，简称 Tosyl），三苯甲基（triphenylmethyl，简称 Trityl）等。

3.2 侧链保护基的选择

侧链保护基的选择是多肽固相合成的重点和难点。不当的保护基可能在合成或纯化中导致无法克服的困难。Fmoc / tBu 基本代表了氨基酸保护基的正交设计。固相载体也算是氨基酸的保护基团。因此氨基酸侧链保护基以及载体的选择都必须仔细的考虑。保护基的选择不仅取决于化学性质，还取决于偶联以及裂解方法的选用、保护氨基酸的溶解性、目的肽序^[15]等。

4、接肽反应方法

在固相合成中，将肽链连接在高分子载体上的最大优点是合成中所有的纯化步骤都被省略，以简单的冲洗和过滤肽树脂代之。并且所有反应及操作均在一个反应器中进行，克服了液相法合成长肽分子时在溶液中难以溶解的问题。但为保证固相多肽合成能得到单一的肽，要求每一步的缩合反应都趋于完全，它不仅要求反应快、而且更重要的是侧链保护基和肽与树脂的连接在整个接肽反应过程中保持稳定。为了便于固相反应时进行搅拌或振荡，一般是用 10 mL 溶剂对 1 g 树脂的比例，这就限制了反应物的浓度，而不能像液相合成那样选用很高的反应物浓度，因而反应速度也受到影响。因此，适合于固相上的接肽反应的方法较少，如缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等。

4.1 原位法（DCC 法）

直接加二环己基碳二亚胺（DCC）和保护氨基酸到树脂中进行反应的方法称为原位法。该法操作简便,反应速度快，产率高。但其主要缺点是在反应中生成的副产物（DCU）在接肽溶剂（DCM）中的溶解度很小，要将其洗涤除去需花费大量的溶剂和时间，甚至虽经多次洗涤，仍会有少量吸附在树脂内部的空隙中而影响以后的反应。而且活化和缩合在一起进行，前述副产物若不能预先除去，就会有连接在肽上的危险。

4.2 对称酸酐法

对称酸酐法是一种非常好的接肽方法，操作简单，产物纯度很好，尤其适合小分子肽的合成^[16]。其优点还有：接肽反应后的产物中不存在用DCC法时所产生的溶解度较小的DCU副产物；活性很高，接肽反应的速度很快。对称酸酐可以合成并以结晶的形式存在，有利于保存。只是由于制备一分子的对称酸酐需要两分子的保护氨基酸，因此对称酸酐法的一个主要缺点是保护氨基酸的用量大，比较浪费。另一个需要注意的问题是保持树脂的溶胀性非常重要。

4.3 缩合剂法

在 DCC 缩合反应中，加入某些添加剂不仅可减少副反应，而且可提高产率。常用的添加剂有 N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu），1-羟基苯并三氮唑（HOBt）和 3-羟基-4-氧-3,4-二氢-1,2,3-苯并三氮嗪（HOObt）^[17]。HOBt 衍生的亚胺正离子型缩合剂，不仅可用于酰胺和酯的合成，且反应活性和抑制消旋化方面都好于脲正离子型缩合剂。最年来 Fmoc 合成法得到广泛运用，其缩合剂多采用TBTU / HOBt / DIEA 为缩合剂^［18,19］，这种缩合剂体系明显缩短了接肽反应的时间，减少副反应发生，也有利的抑制消旋反应的出现，是缩合剂选择的趋势。

5、未反应氨基的封闭

由于在固相合成中，第一轮缩合循环所留下的未反应氨基将会在第二轮缩合循环中继续和羧基组分反应，产生肽链内部少掉某一个氨基酸的内缺失肽。这些内缺失肽的理化性质很可能和所需要产物的性质非常相近，从而给最后产物的纯化造成很大的困难。为了避免这种缺失肽的生成，一般可以选用主动封闭氨基的办法。其方法有：(1) 用醋酐或乙酰咪唑乙酰化；(2) 用甲酰异丙烯酯甲酰化；(3) 用荧光胺反应；(4) 用3-硝基邻苯二甲酸酐反应；(5) 用3-磺酸丙酸的内酸酐反应。

6、脱去保护基和树脂

合成肽的最终脱保护基和从树脂上裂解不仅决定合成的成败，而且也决定了侧链保护基的选择等固相合成多肽的计划的确立，因此是肽合成中极重要的环节。目前最常用的脱保护基系统是三氟乙酸（TFA），氢氟酸（HF），有机磺酸（TFMSA、MSA) 和含硅试剂（TMSBr、TMSOTf）^[10] 。

7、多肽固相合成法中存在问题

虽然多肽固相合成法经过后人的不断改进和完善，已经能够合成很多具有生物活性的多肽，但是其本身还是存在着很多问题。这些问题的存在大大限制了多肽固相合成法的应用范围。

7. 1 合成多肽的序列短

自从 B Merrifield 发明了多肽固相合成法后，尽管在肽链合成后的性质、合成后分析等方面有了很大提高，但是当肽链残基大于 30 个，尤其是超过 50 个时，肽链的合成就会受到一定程度的限制。这是由于在多肽固相合成时，对于聚合物局部来说，合成肽的浓度较低，在激活羧基时，虽然使用叠氮法能有效防止外消旋的发生，但是反应进行得相当慢。由于这些种种原因，使得多肽固相合成被局限于合成小片段多肽。

7. 2 合成所需时间较长

经过三十多年的发展，多肽固相合成的速率有了很大的提高，但是相对其它合成方式（ 如生物合成法）来说，链的合成速率仍然很慢。每结合上一个氨基酸需要 20 ~ 120 min ^[20]，平均一个九肽的合成需要 5 h 以上，这主要取决于化学选择和接下来的合成策略。另外，当合成较困难的多肽序列时，链的结合时间更长。

7. 3 合成的效率和纯度低、成本高

随着氨基酸数量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增长，目的肽的纯度逐步降低，后续的纯化和复性愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵，致使多肽合成的成本很高。

7. 4 合成试剂的毒性大

进行多肽合成的试剂的毒性很大，如 DCM、DMF、哌啶等这些有机化学试剂，在成为废液后都需要报环保局进行处理。虽然有些仪器能提供合成过程全封闭进行，但其排出的废气废液等，还是对环境有污染。

8、固相法多肽合成前景展望

多肽类化合物广泛存在于自然界中，是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。自从生物化学家用人工方法合成多肽以来，伴随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，多肽的研究取得了划时代的进展。有关专家认为，肽和蛋白质将成为今后最有希望的临床治疗与保健药物； 美国著名科学家、诺贝尔奖获得者朱棣文博士也曾预言：21 世纪的生物工程就是研究基因工程与蛋白质工程。直接从动物或植物中提取蛋白质或多肽，将会造成很大的资源浪费。利用重组表达或通过发酵液进行发酵，纯化样品又是一大问题。而通过多肽固相合成则能够同时避免这两大问题。通过合成技术的不断成熟，合成仪器的不断改进，扩大可合成蛋白质的范围，缩短合成时间，减少合成成本等，同时通过多肽固相合成法，可以引进稀有氨基酸，进行新的蛋白质的结构与功能的研究。多肽固相合成法在药物研究领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域等呈现着不可比拟的优越性。相信经过全世界科学家们共同努力，在不久的将来，随着多肽固相合成方法和工具的改进，将会有越来越多种类的多肽和蛋白质可用固相合成法来生产，并且合成速率及合成的效率会得到改善。多肽固相合成法在生物制药及蛋白质工程中有着广阔的应用前景。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1. 树脂的改造和封头

称取cl树脂1.0005 g，fmoc-ala-oh 0.1267 g依次加入到反应器中，加入8 ml的dcm使之成流动型，再加入800 micro;l diea，放置于调速震荡器上，改造40 min。往溶液中再加入1ml甲醇和diea以及适量的dcm，封头20 min。

2. 洗涤