1. 研究目的与意义（文献综述）

1. 传染性海绵状脑病（TSE）形成一组致死的神经退行性疾病，这种疾病对人类和其他哺乳动物都有影响。关于其传染性病原体被广泛接受的是“纯蛋白”假说。该假说指出感染因子由正常细胞蛋白的修饰形式组成，即正常蛋白PrPc可以通过某种自催化过程转化为错误折叠的病理形式PrPsc。PrPsc在生物体内会聚集形成一种淀粉样纤维蛋白，对蛋白酶有很大抗性，且不易溶解。PrPc的结构已有报道，其特点是具有高度灵活的N端尾巴和有三个α螺旋和两个短的反平行的β片层构成的球状C端结构域。而PrPsc三维结构还没有明确报道，但相关研究发现其结构主要由β-折叠组成，同时形成无定型淀粉状蛋白样聚集体。这种错误折叠过程是其病理学的中心事件，得到PrPsc的三维结构，从结构出发探索其错误折叠机制，了解致病机理，对于该类疾病控制和药物研发具有指导性意义。
2. 现阶段对于各种重组PrP片段的纤维蛋白的结构研究较多，但对于全长重组的PrP由于其形成纤维的分子结构具有较低分辨率，对其相关的结构研究并不多。在我们的工作中，利用大肠杆菌表达得到重组型的PrP全长纤维样品，通过优化制备条件得到的样品结构较为均一，分辨率较好。利用固体核磁共振技术研究其结构特点，构建三维结构模型，以结构模型为基础探索该纤维的折叠机制，为解释朊病毒的错误折叠机理提供参考。
3. 由于PrP蛋白的独特性质，使得依靠体内研究来得到蛋白结构基础和相关生物物理转变机理困难重重。后来发现细菌表达的全长重组PrP和各种PrP片段能够在体外形成淀粉样原纤维，并且重组PrP原纤维具有细胞毒性，这表明我们可以通过体外研究来解释生理状态下其蛋白结构和行为。
4. 了解这些淀粉样纤维中不同肽的详细结构对于研究淀粉样蛋白纤维的形成机制十分重要。然而，纤维是不可溶的非晶体材料，限制了X射线晶体衍射和液体NMR方法的应用。后续开发了多种固体核磁共振技术，并成功解决了一些结构和动力学上基本问题。利用同位素全标、稀疏标记以及混合标记的方式，固体NMR显示各类PrP片段以及全长PrP形成的纤维主要是β-片层结构，已报道的PrP127-147和PrP106-126，PrP23-144形成的原纤维含有平行的β-片层，也得到了PrP109-122原纤维中反平行β-折叠的证据。而对于全长PrP其刚性的β折叠结构集中的C端，N端结构柔性或者无规。除了固体NMR方法，原子力显微镜（AFM）和电子显微镜（EM）可以用于观测纤维的整体形态；H-D交换的方法可以得到纤维的疏水核心区域，已有相关研究表明PrP全长纤维样品的疏水区域集中在C端；透射扫描电镜（STEM）可用来定量确定纤维的MPL值，由此可知单个纤维横截面上蛋白的聚集数目，该技术广泛应用于Aβ40、Aβ42和HET-s等纤维多聚体的结构计算中。
5. 虽然有很多关于PrP片段的结构和动力学研究，对于我们理解PrP蛋白的特性提供了依据。但对于全长PrP蛋白，由于其形成的淀粉样原纤维的分子结构具有多态性，样品在固体核磁中的分辨率低，一直没有得到一个高分辨的结构模型。然而全长PrP纤维的结构以及其折叠机制，对于解释其在生理状态下其蛋白的错误折叠机理更具有说服力，这也将是该领域致力于解决的重大问题之一。

2. 研究的基本内容与方案

1. 我们利用大肠杆菌表达得到全标记重组型PrP全长蛋白纤维，通过优化制备条件得到均一性、分辨率较好的样品，然后利用固体核磁共振的方法采集NCACX,NCOCX,CONCA三维实验以及NCA，DARR等二维实验得到核磁谱图，利用数据处理软件nmrpy、sparky采用主链行走的方法得到其残基化学位移，并分析其结构特点。通过分析其纤维蛋白的结构，对比可溶性单体的PrPc蛋白结构，试图找到其折叠的原理，探索错误折叠机制，为解释生理状态下PrPc错误折叠成PrPsc的相关生物物理过程提供参考，为相关疾病药物的开发提供依据。
2. 在样品制备方面我们首先是需要优化蛋白表达纯化条件，预计得到分辨率较好的¹³C、¹⁵N全标样品，得到信噪比和分辨率各方面合适的样品，然后在样品表征方面利用固体NMR魔角旋转方法得到高分辨的核磁信号，优势在于与液体核磁相比固体核磁不受蛋白分子量的限制，再利用主链归属等方法得到氨基酸主链和侧链的化学位移信息；在完成化学位移归属情况下，再利用结构分析软件得到其二级结构和三级结构信息，探索其折叠机制。

3. 研究计划与安排

第1周：了解论文题目，认识所需完成的主要内容和任务；搜集相关学术期刊、论文、文稿、专利、教材等资料，了解蛋白研究背景和学术前沿。

第2-3周：完成毕业论文开题报告，确定实验技术路线，确定具体的实验方案和步骤。

第4-5周：提取淀粉样蛋白纤维，通过核磁共振谱仪得到三维共振核磁谱，进行化学位移归属。

4. 参考文献（12篇以上）

[1] mammalian prion protein (prp)forms conformationally di#64256;erent amyloid intracellularaggregates in bacteria. macedo et al. microb cell fact (2015) 14:174

[2] the a-helical c-terminal domain of full-length recombinant prpconverts to an in-register parallel β-sheet structure in prp fibrils: evidencefrom solid state nuclear magnetic resonancebiochemistry, vol. 49, no. 44, 2010

[3] prion protein biology. cell, vol. 93,337–348, may 1, 1998, copyright #63721;1998 by cell press