谷氨酸棒杆菌分泌表达载体的构建与表达

摘　要 　蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分，是生命的物质基础。采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。因此利用外源基因进行重组蛋白的分泌表达，具有无限广阔的研究前景。长期以来，大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统，有着独特的优势，也有着一定的缺陷。微生物重组蛋白分泌表达有着很大优越性。将谷氨酸棒杆菌作为表达宿主，以绿色荧光蛋白进行尝试性的构建与表达。

关键词 基因重组、外源基因、重组蛋白、分泌表达、原核表达

一、立论依据

20 世纪 70 年代初在遗传学、分子生物学、生物化学、微生物学等学科发展的基础上，出现了基因工程技术( 又称重组DNA 技术)^[1] 。该技术通过在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并将其导入宿主细胞内 继而在新的遗传背景下得到稳定扩增及表达。重组蛋白表达技术是研究蛋白质功能、结构，以及筛选靶向药物的有力工具，在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。

迄今为止,它已经建立了大量的基因表达系统,原核表达系统，真核表达系统，动物表达系统，植物表达系统等^[2]，而不同的表达系统有着不同特点优势，但也有其不足之处。

重组蛋白获得途径可以分为体外方法和体内方2种法。当前主要应用的重组蛋白的表达载体包括原核细胞如大肠杆菌、真核细胞如酵母、昆虫细胞以及CHO细胞。

在各种诸多的不同的表达系统当中，大肠杆菌的表达系统是第一个研究的表达系统，也是目前最成熟的表达控制系统^[3-4]。主要方法是将目标基因克隆到载体DNA片段（通常是质粒）转化的细菌（大肠杆菌通常使用）等由IPTG诱导和所需最终纯化的蛋白质。作为国内最早和最广泛使用的经典表达系统和大肠杆菌表达系统的发展具有范围广泛遗传背景清楚，繁殖快，成本低，高表达，表达产物易于纯化，稳定性好，强抗污染等^[5]。但在同一原核表达系统有许多缺点难以克服的：如果目标蛋白质通常表示为包涵体^[6]，导致在产物提纯困难;另外就是在原核表达系统中修饰系统的翻译加工是不完善

的有缺陷的,从而导致生物活性产品的表达效率较低。

外源重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达，生成的蛋白更加接近于天然蛋白，只一点，就是其它表达系统所无法比拟的。通过质粒转染和病毒载体获得表达。质粒转染后需要数周或数月获得稳定转染细胞，这个周期很漫长。而病毒表达系统的使用是感染细胞的一种快速途径，可在几天内将外源基因整合到病毒载体中，特别适合于从大量的表达产物中检测到目标蛋白。另外哺乳动物细胞表达载体要求更高，必须包含原核序列、启动启动子和增强剂、选择标记基因、终止子和聚核苷酸信号控制元件^[7]。根据靶蛋白表达的空间和时间差异，将其分为瞬时性、稳定性和诱导表达系统。