文 献 综 述

一、研究意义与前景

1.1生物膜的耐药性

生物膜细胞拥有比游离细胞更强的抗药性是如今公认的两者之间最显著的区别。临床经验发现，在实验室环境下可以有效杀灭细菌微生物的药物在体内治疗时却很难完全清除致病菌，通过大量此类案例的研究发现，体内细菌的这种抗药性不仅与细胞本身耐药性的增加有关，还与细胞形成的生物膜有关。当细菌形成生物膜后，其抗药性往往比单细胞状态增强10-1000倍，因此生物膜的形成已是细菌耐药性形成的重要机制之一。随着现代医学高科技的发展，越来越多的植入型医学材料（气管导管、静脉导管、导尿管等）成为某些细菌在体内生长成膜的”温床”，这些致病菌一旦在此类生物医学材料表面形成生物膜，往往很难得以彻底清除，并同时伴随着疾病的反复发作，最终不得不重新更换植入体，给患者带来了巨大的痛苦和经济负担。因此对致病性感染生物膜的研究将对防止临床性感染疾病有重要的意义。随着对生物膜结构、成分及基因水平的研究，人们提出了多种有关细菌生物膜耐药性作用的机理和假说，例如屏障保护作用；营养限制学说；抗性基因的表达；主动防御机制及群体响应防御机制等。这些机制和假说的提出加速了人们对于细菌生物膜耐药性的理解，也为根治慢性复发性感染疾病提供了理论依据。

二、生物膜相关疾病

1．基本概念 由于生物膜基础研究的进展，极大地激发了人们对疾病状态下生物膜的改变以及生物膜治疗剂等在疾病的预防与治疗等实际医学问题的研究兴趣，并已取得了一些成果。 许多资料表明，生物膜与红细胞和血小板的功能、动脉粥样硬化、自由基及脂质过氧化损伤、乙醇毒性、衰老、膜受体缺陷性疾病、呼吸窘迫综合征、神经肌肉疾患、肿瘤等的发生密切相关。根据病因及发病机制可将生物膜相关疾病分为： （1）原发性或特发性生物膜相关疾病，如家族性高胆固醇血症等膜受体缺陷性疾病，以及遗传性球形红细胞增多症和阵发性睡眠性血红蛋白尿等红细胞膜缺陷性疾病。 （2）继发性生物膜相关疾病，即各种疾病状态下生物膜的改变，即各种致病因素作用于生物膜，引起生物膜化学组成发生改变，常表现为卵磷脂减少和/或胆固醇、鞘磷脂增多，导致生物膜结构和功能受损，膜脂流动性下降，从而形成生物膜相关疾病。有研究表明，细胞膜流动性正常是细胞行使生理功能的一个重要因素，仅仅细胞膜流动性异常就能造成细胞功能紊乱或破坏。

2．自由基与生物膜 自由基反应参与机体中许多重要的生理、生化过程，自由基生成与消除失平衡，或自由基在局部生成增多与许多疾病有关。许多外源性分子经过肝细胞内质网膜中细胞色素P450的代谢后形成中间产物，这类活性中间产物往往都是自由基或亲电性物质，它们能与细胞内重要大分子物质结合，或引起生物膜脂质过氧化，或使整合的生化过程脱偶联，最后引起细胞损害或死亡。生物膜脂质过氧化的结局一方面是膜内高分子量的蛋白质聚合物、脂质聚合物以及蛋白质与脂质聚集物的不断形成，另一方面是脂肪酸链的不断分解与断裂，膜流动性下降，刚性增加，最后膜完整性丧失。机体内严重的自由基损伤时，往往伴有代谢障碍，如酸中毒、钙超载等。特别是在严重缺血后，线粒体呼吸链有氧氧化受抑制，胞内NADH增加，使B氧化反应中的B-羟乙酰辅酶A脱氢酶受抑制。因此，长链脂肪酰辅酶A和长链脂肪酰肉毒碱浓度增加，而这些物质都属于兼性物质，具有”去垢剂”样作用。前者主要聚集在线粒体，后者在胞浆，它们在低浓度时以单体形式插入膜脂双层，浓度高时形成微囊进入膜脂，破坏脂质双层结构；此外，它们还能吸收膜脂成分，形成既含兼性物质又含膜脂成分的混合微囊，其结果加重生物膜损伤，使膜脂失去脂质双层排列。

三、研究背景

（1）生物膜概述

生物被膜又称生物膜是在生物或非生物介质表面由微生物及其保外基质形成的致密、复杂的生物聚集体。在地球上，生物膜是最为普通的微生物存在形式之一，超过90%的细菌可以以生物膜的形式存在，超过80%的细菌性感染疾病与生物膜有关。在我们的周围到处都可以发现生物膜的踪迹，例如树木表面覆盖的各色菌斑，石质文物表面及周边岩石样品中的微生物菌落，牙釉质表面的菌斑生物膜等。早在1683年，荷兰显微镜学家Antony van Leeuwenhoek在寄往英国皇家学会的信中写到其利用自制的显微镜对牙菌斑里的微生物进行了观察和描述，这是最早由关细菌生物膜的科学研究。此后生物膜研究进展缓慢，直到1978年Costerton等才首次提出生物膜的相关理论，20世纪70年代末生物膜作为独立学科得到迅速发展。1990年，蒙大拿州立大学建立了世界上第一个生物膜生物工程实验中心，1991年，加拿大国立水环境研究所的John R.Lawrence等人首次阐述了细菌生物膜的三维立体结构。现如今，随着人们逐渐意识到生物膜在细胞感染疾病中的重要影响及在工业生产中展现出的优良特性，生物膜的研究越来越受到国内外研究者的重视。

（2）生物膜的结构、组成

不同微生物细胞形成的生物膜其结构组成亦不相同，即使同一种微生物在不同生长阶段及环境条件下也会形成成分各异的生物膜。大自然中的许多生物膜是由多物种微生物组成的，这不仅增加了生物膜的多样性，也直接导致了生物膜结构和组分的复杂性。在实验室环境下，为了研究的便利，研究者通过培养单一物种的微生物来形成生物膜，然后进行生物膜的分析。研究发现，生物膜是一个极其复杂又高度有组织性的微生物聚集体，其存在形式如同一座城市一般。在其中微生物细胞就好比是人类，胞外多糖聚合”骨架”如同城市中的楼房建筑，物质运输的水通道就像是城市中的道路管道，人类复杂的互联网体系就好比是生物膜表面及内部的信号感应和传导系统。由此可见，要更深入的了解生物膜的生理生化特性及生存机制，就必须要了解生物膜复杂的结构组成。成熟的生物膜是一种成分不均质的粘性复合物，其中超过百分之九十的组分是水和菌细胞。胞外多糖、蛋白组、脂类和DNA及一些小分子酶类也是生物膜中常见的组成成分，这些物质或来自于细胞的主动分泌或来自于破裂死亡细胞的被动释放。此外，生物膜周围环境中的各种小分子物质及有机无机物质也会被包裹在生物膜基质中，这些成分的加入不仅增加了生物膜成分的种类也赋予生物膜更多种多样的生物形态。

（3）生物膜的形成

生物膜的形成是一个动态的时空生长过程，根据生物膜在不同生长时期所表现出来的外貌表型及内部细胞存在的形式，一般将生物膜的生长过程分为五个发展时期：

图1生物膜的形成发展过程

①初始粘附期。游离的单细胞微生物刚刚附着到介质表面的时期，此时的微生物与介质表面之间的作用力较弱，细胞之间缺乏紧密的粘附力，细胞在介质表面的固定并不牢固。次阶段的固定细胞可以再次回到单细胞的游离状态。

②对数生长固着期。固着的细胞不断繁殖生长，并开始大量的分泌胞外基质。微生物细胞被胞外基质粘连在一起并牢牢地附着于介质表面，在此阶段，生物膜内部的细胞基本不能回到原来的单细胞游离状态。固体表面的生物膜整体成点斑状分布。

③时空立体发展期。附着在介质表面的菌细胞进一步大量繁殖并相互聚集成群，点斑状的生物膜开始联接进而成片出现。生物膜不仅仅发生横向发展，也开始向空间纵向生长。

④成熟稳定期。生物膜发展的顶峰时期，微生物形成了具有三维立体结构的微菌落。生物膜因不同的外部环境会呈现出各种各样的菌落形态，典型的结构有蘑菇状、扁平状或流线状等。此阶段的生物膜具有最稳定的生理结构和最强的环境抗性。

⑤扩散及瓦解期。成熟稳定的生物膜由于营养、温度、pH等外部环境的变化而出现的”破裂”现象。对此阶段的生物膜形态变化存在两种解释：a.生物膜为繁殖延续生命而采取的一种主动的破裂，并释放出生物膜内部的单细胞进而在异处起始新的生物膜，是一种繁殖传代现象；b.生物膜迫于生出环境的恶化，而造成的一种被动的组织结构的破裂现象，是一种衰亡的征兆。

（4）生物膜形成中相关多糖

参与生物膜形成的多糖主要是细胞间粘附多糖（polysaccharide of intrcellular

adhension,PIA)。在早期细菌向多聚材料的粘附和后期细菌间的相互粘附过程中都有

PIA参与，但PIA主要参与细菌间的聚集和细胞外粘液的形成。生物膜中分离得到的

PIA为线形多聚β-1,6-2脱氧-2-氨基-D-吡喃葡萄糖；PIA是N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,6糖苷键连接成线性无分支的糖链；10%-30%的去乙酰化，有琥珀酰化和磷酸化。在生物膜中同时也分离到另一种多糖PSA，其结构与PIA相似，但PSA在氨基上有70%-90%琥珀酰化代替乙酰化；而且PSA和PIA都有ica基因编码的糖基转移酶合成，所以近年来认为PIA和PSA是同一种多糖，只是由于分离纯化的方法所致。PIA至少由130个N-乙酰氨基葡萄糖残基组成的线性分子（lt;30000kD）,是主要的生物膜的组成成分，参与细菌之间的聚集和细胞外粘液的形成。PIA可分为两类：PIAⅠ和PIAⅡ。PIAⅠ（gt;80%）是PIA的主要多糖成分，其中有15%-20%去乙酰化二带正电；PIAⅡ（lt;20%）的结构与Ⅰ相似但是比Ⅰ有较少的去乙酰化，且带有磷酸基团和被琥珀酰基修饰形成的脂键，所以PIAⅡ带有负电。两种多糖带有不同电荷的有利于相互作用和生物膜形成。其中PIA的乙酰化的糖基是合成的糖链后再去乙酰化形成的，去乙酰化作用受一些酶的催化。Ica（intercellular adhesion）基因是PIA合成的相关基因，是典型的原核操纵子的结构。

Ica操纵子包括负调节相关的IcaR和结构相关的IcaADBC，而其中IcaR的转录方向与IcaADBC相反。IcaR的表达能抑制IcaADBC的转录，IcaR基因确实能使IcaADBC表达增强，但精确的IcaR特异性作用位点还不清楚。IcaADBC是Ica基因的结构部分，该基因的表达的蛋白参与多糖的合成。表达的IcaA,D,C主要位于细胞膜上，IcaB则主要存在于培养上清中。IcaA有四个跨膜结构，1个在N端3个在C端，具有β-糖基转移酶的活性，N-乙酰基葡萄糖和氨基葡萄糖可作为其底物合成多糖链。IcaA在膜上形成正确的结构需要IcaD的辅助，IcaD可能作为伴侣帮助IcaA折叠成正确的活性形式；当IcaA和IcaD共表达时，IcaA的活性较其单独表达时增加20倍，而IcaD本身没有糖基转移酶的活性IcaD和IcaA以复合物的形式存在于细胞膜上，有两个跨膜结构，膜上的IcaD也可能作为IcaA和IcaC之间的联系。如果只有IcaAD的存在则只能形成20个糖基的糖链，只有42kD的IcaC参与才能形成大于130个残基完整的PIA。PIA的去乙酰化糖基是在完整糖链合成后进行去乙酰化作用而合成的，而33kD的IcaB存在于培养液，其序列与参与壳多糖合成的去乙酰化相似，推断IcaB可能参与了去乙酰化的过程。

图2为Ica基因的结构

四、生物膜的调控机制

4.1各种有关生物膜调控的假说

4.1.1密度信号感应（Quorum sensing）系统

密度信号感应系统是普遍存在于生物膜中的一种特异性基因表达调控系统，它可以调节生物膜的群落大小和群落中细胞的密度以适应变化的生活环境。在生物膜形成的早期阶段，细胞数量较少，此时的密度感应系统通过激活细胞内的特异性代谢途径来促使细胞大量的繁殖，维持细胞高增长的态势，同时诱导细胞分泌大量的胞外基质；当生物膜的生物量达到或接近”饱和”时，此时与密度有关的调控系统启动负反馈机制，调控细胞的生长速度，防止细胞过度生长繁殖，保持生物膜的生物量在一个合理的范围。如此看来，密度感应系统是生物膜为适应变化莫测的外界环境而进化的结果，有利于维持生物膜种群的延续。现如今，在生物膜中已经发现了三种类型的密度信号调控机制：一类是以革兰氏阴性菌为代表的酰基高丝氨酸内酯（acly-homoserinelactone, AHL）类密度信号感应系统；一类是以革兰氏阳性菌为代表的呋喃酰硼酸二酯信号分子的密度感应系统；第三类是既存在于革兰氏阳性菌中也存在革兰氏阴性菌中的密度信号感应系统。研究发现，密度信号感应系统对于维持生物膜的环境抗性具有重要的意义。

4.1.2 渗透阻碍作用

生物膜中细菌周围致密的胞外基质被认为是影响生物膜渗透限制作用最主要的因素，其形成的分子筛作用和电荷屏障作用有效的延缓或阻止某些抗生素物质在生物膜内的渗透。生物膜中较高的细菌浓度和致密的胞外基质使得细菌与细菌直接的信号沟通更便捷，同时也造成了生物膜内部狭小的空间。这种结构减缓了外部毒性物质渗入生物膜内部的速度，增加了毒性物质到达生物膜内部细胞表面的路径，减小了生物膜内部细胞接触到毒性物质的几率。即使有些小分子物质最终到达生物膜内部的细胞表面，由于其浓度的不足也无法对细胞造成致命的伤害，相反却成为导致细胞抗性增强的诱导物。电荷作用是导致胞外毒性物质尤其是某些抗生素抗性减弱的又一因素。抗生素多肽链中带正电的氨基侧链容易被生物膜基质组分上的负电荷吸附，导致抗生素无法在生物膜基质中继续渗透，降低了抗生素的杀灭功效。然而，渗透阻碍作用还不能完整的解释生物膜的耐药性，研究中发现即使一定浓度的抗生素突破生物膜基质的重重阻碍最终到达生物膜内部，仍然有一部分细菌能够抵抗抗生素的药物作用而存活下来，这说明生物膜的抗性是多方面因素共同作用的结果。

4.1.3基因表达耐药学说

生物膜细胞基因水平的研究发现，和游离的细胞相比生物膜细胞中有大量的基因表达发生了不同程度的上调和下调，这些基因被认为是和生物膜的耐药性及抗性有关。对比生物膜细胞和游离细胞，铜绿假单胞菌中有1%的基因发了差异表达，0.5%的基因被激活，0.5%的基因被抑制。生物膜状态下的大肠杆菌中有大约38%的基因被认为是和生物膜的形成有关，在大肠埃希菌生物膜细胞中有10%的基因的表达明显不同于游离细胞。研究还发现，在生物膜中还存在一种主动防御机制，当生物膜受到抗生素的攻击时，生物膜细胞会主动调控一些酶基因的表达，分泌特异性的抗生素酶，导致酶活性的下降甚至失活。另一种主动防御机制是生物膜细胞通过表达某些膜转运蛋白和物质转运泵，主动的将抗生素物质排出细胞，从而保护细胞的一类主动防御机制。

4.2 Flo基因家族

致病性微生物已经进化出了各种响应环境变化的反应机制，这些反应机制通常需要一系列的编码特殊蛋白的基因调控。真核生物编码此类调控细胞与介质表面相互作用的糖蛋白来促进细胞的粘附性能，如白色念珠菌中的ALS基因家族、光滑假丝酵母中的EPA基因家族等。在酿酒酵母中有类似的基因家族#8212;#8212;FLO基因家族，编码一系列的蛋白来调控细胞在琼脂、固体介质表面的粘附作用。现已知FLO基因家族共有5个基因构成（Flo1、Flo5、Flo9、Flo10和Flo11），其中Flo1、Flo5、Flo9、Flo10基因紧邻他们各自的端粒，促进细胞之间的粘附。然而Flo11基因既不邻近端粒也不紧靠着丝点，通过编码GPI细胞表面锚定蛋白来调控生物膜的形成。在酵母菌Σ1278b的成膜过程中Flo11是唯一表达的FLO家族基因，其他基因都是沉默的。在酿酒酵母中Flo11基因通常是不表达的，只有在特定的环境下Flo11基因才会被表达。现已发现Flo11基因和酵母絮凝、介质表面吸附以及生物膜的形成有很大的关系。在细胞体内Flo11基因的表达受到各种代谢路径的调控，如糖代谢、氨基酸代谢、脂代谢等，信号代谢通路cAMP-PKA/MAPK以及葡萄糖信号路径等也被证实能够通过将胞外的信号刺激信息传递入细胞内，进而调节Flo11基因的表达来调控细胞与细胞之间以及细胞与介质之间的相互作用。

参考文献

1、Li Z, Chen Y, Liu D, et al. Involvement of glycolysis/gluconeogenesis and signaling regulatory pathways in Saccharomyces cerevisiae biofilms during fermentation[J]. Frontiers in microbiology, 2015, 6.

2、 Basak S, Rajurkar M N, Attal R O, et al. Biofilms: A Challenge to Medical Fraternity in Infection Control[J]. INFECTION CONTROL, 2013: 57.

3、 Costerton J W, Stewart P S, Greenberg E P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections[J]. Science, 1999, 284(5418): 1318-1322.

4、 Costerton J W, Geesey G G, Cheng K J. How bacteria stick[J]. Scientific American, 1978 (238): 86-95.

5、 Lawrence J R, Korber D R, Hoyle B D, et al. Optical sectioning of microbial biofilms[J]. Journal of bacteriology, 1991, 173(20): 6558-6567.

6、 Sutherland I W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework[J]. Microbiology, 2001, 147(1): 3-9.

7、Johnston N. Debaffling biofilms[J]. The Scientist, 2004, 18(15): 34-35.

8、 张惟杰 复合多糖生化研究技术 上海科学技术出版社 1987

9、Mack D.Nedelmann M.Krokotsch A,Schwarzkopf A,et al. Characterization of

transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production:genetic identfication of a hexosamine-containing polysaccharide intercellular adhesin.Infect Immun.1994 Aug;62(8);3244-53

10、袁丽红 微生物学实验 化学工业出版社 2010

11、Cramtom SE.Ulrich M.Gotz F ,et al.Anaerobic conditions induce expression of polysaccharide intercellular adhesin in Staphylocaccus aureus and Staphylococcus epidermidis.Infect Immun. 2001 Jun;69(6):4079-85

12、周德庆 微生物学教程(第3版) 高等教育出版社 2011

13、Frebourg NB, Lefebvre S,Baert S,et al.PCR-Based assay for discrimination between invasive and contaminating Staphylococcus epidermidis strains.J Clin Microbiol.2000 Feb;38(2）：877-80.

14、百度百科，丙酮丁醇梭菌的概念

15、董红军 丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统 《生物工程学报》2010年第10期1372-1378

16、丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造 《中国生物工程杂志》2009年第10期109-114

17、Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms Lisa Friedman and Roberto Kolter Molecular Microbiology (2004)51(3),675-690

18、表皮葡萄球菌ica操纵子与细胞间多糖粘附素及生物膜表型的相关性 《华中科技大学学报：医学版》2008年第4期449-452

19、百度百科，生物膜与疾病

20、Multiple regulators control capsular polysaccharide production in Vibrio parahaemolyticus.

21、Control of biofilm formation and colonization in Vibrio fischeri: a role for partner switching