1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

一、核苷酸概述

1.1 核苷酸简介

核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物,为核酸的基本结构单位[1]。人体内的核苷酸主要由机体细胞自身合成,细胞中主要以5′-核苷酸形式存在。细胞中核糖核苷酸的浓度远远超过脱氧核糖核苷酸。不同类型细胞中的各种核苷酸含量差异很大，同一细胞中，各种核苷酸含量也有差异，但核苷酸总量变化不大[2]。许多单核苷酸也具有多种重要的生物学功能，如与能量代谢有关的三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等。某些核苷酸的类似物能干扰核苷酸代谢，可作为抗癌药物。根据糖的不同，核苷酸有核糖核苷酸及脱氧核苷酸两类。根据碱基的不同，又有腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）、鸟嘌呤核苷酸（鸟苷酸，GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸， CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黄嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）等[3-5]。

1.2 核苷酸的结构与理化性质

脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的结构简式如下:

核苷酸由核糖(或脱氧核糖)核酸碱基和磷酸键合而成，一般为白色粉末或结晶状物，微溶于水，水溶液呈酸性，不溶于丙酮、乙醇等有机溶剂[6]。具有旋光性，在260nm左右有强吸收峰。

1.3 核苷酸的功能与应用

1.3.1 核苷酸的功能

核苷酸类化合物具有重要的生物学功能，它们参与了生物体内几乎所有的生物化学反应过程。现概括为以下五个方面：

① 核苷酸是合成生物大分子核糖核酸 (RNA）及脱氧核糖核酸(DNA）的前身物，RNA中主要有四种类型的核苷酸：AMP、GMP、CMP和UMP。DNA中主要有四种类型脱氧核苷酸：dAMP、dGMP、dCMP和dTMP。

② 三磷酸腺苷 (ATP）[7]在细胞能量代谢上起着极其重要的作用。如物质的合成代谢、肌肉的收缩、吸收及分泌、体温维持以及生物电活动等。因此可以认为 ATP是能量代谢转化的中心。

③有些核苷酸衍生物还是活化的中间代谢物。例如，UTP参与糖原合成作用以供给能量，并且 UDP还有携带转运葡萄糖的作用。

④ 腺苷酸还是几种重要辅酶，如辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，（NAD ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD）（NAD 及 FAD是生物氧化体系的重要组成成分，在传递氢原子或电子中有着重要作用）及辅酶A（CoA）（CoA作为有些酶的辅酶成分，参与糖有氧氧化及脂肪酸氧化作用）等。

⑤ 核苷酸对于许多基本的生物学过程有一定的调节作用。一切生物体的基本成分，对生物的生长、发育、繁殖和遗传都起着主宰作用。

1.3.2 核苷酸的应用

① 调味料：鸟苷酸（GMP）、肌苷酸（IMP）等核苷酸属于呈味性核苷酸[8]，除了本身具有鲜味之外，还有和左旋谷氨酸（味精）组合时，有提高鲜味的作用，作为调料、汤料的原料使用。

②食品添加剂：母乳中含有尿苷酸（UMP）、胞苷酸（CMP）、腺苷酸（AMP）、鸟苷酸（GMP）、肌苷酸（IMP）等多种核苷酸，为提高婴儿的免疫调节功能和记忆力发挥着作用[9]。中国也有专利介绍添加核酸或核苷酸的高能牛奶，易被人体吸收，具有促进血液循环，改善脑机能，促进新陈代谢，抗疲劳，抗辐射，增强体制，提高免疫力等作用。

③医疗医药：可抑制尿道发炎，在美国也有作为免疫调节剂给手术后的患者使用的例子。

1.3.3 核苷酸的发展前景

近年来，市场对核苷酸量的需求和纯度要求不断提高，核苷酸正越来越广泛地应用于饲料、医药原料及中间体、食品添加剂、保健品及化妆品等领域[10]。目前，中国对于呈味核苷酸的需求量越来越大，可以说，无论是国内还是国际市场，核苷酸及其相关产品都是供不应求。

二、核苷酸的分离纯化方法

2.1 纸电泳法[11]

纸电泳法是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。由于碱水解得到的A、U、G、C单核苷酸，是两性电解质，在一定的pH值条件下，所带电荷多少不同，可用纸电泳的方法进行分离。但因为纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其它快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。

2.2 反相高效液相色谱法

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离，具有快速，操作简便的优点。但分离的核苷酸种类有限，只限于分析某些食品中的部分呈味核苷酸，方法也有一定的局限性。

2.3 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法[12]，是近年来发展最快的分析方法之一,是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法，具有很高的分离效率，能将各种核苷酸很好的分离，但目前这种新型仪器主要靠进口，价格昂贵，使用这种仪器受到一定条件的限制。

2.4 离子交换色谱法

离子交换法[13]是利用离子交换剂和溶液中各种离子之间的结合力的差异对不同物质进行分离的方法。离子交换法具有选择性高、交换容量大、便于自动控制、分离操作容易等优点而广泛用于核苷酸的分离。由于核苷酸带有几种可解离基团，其中含氮环上的-NH2（除尿苷酸外）pKa2值差别较大，导致各个核苷酸的pI值有显著差别，所以在进行离子交换层析时它们与离子交换树脂的吸附树脂能力是不同的。离子交换法的缺点为：阴离子交换树脂在交换之后需要酸、碱进行再生，分离过程中再生剂的用量大，会产生大量的废水，对环境的污染较大。

2.5 膜分离技术

膜分离过程以选择透过性膜作为分离介质, 通过在膜两侧施加某种推动力( 如压力差、蒸汽分压差、浓度差、电位差等) , 使得原料侧组分有选择性地透过膜, 从而达到分离、提纯和浓缩的目的。针对不同的料液及工艺处理要求，选择合适的膜工艺，对料液进行有效的分离、过滤澄清、浓缩，降低能耗、提高产品的质量和收率、减少环境污染，从而降低生产成本，促进效益。目前关于膜法分离核苷酸[14]的相关文献鲜见报道，然而，鉴于膜技术广泛的应用领域及先前的文献调研，我们有理由相信膜分离技术在核苷酸的分离方面大有研究以及应用前景。

表1.核苷酸分离纯化技术的比较

三、离子交换膜技术及其研究进展

3.1 离子交换膜定义

离子交换膜[15-16]是膜状的离子交换树脂。它包括三个基本组成部分即高分子骨架、固定相基团和基团上的可移动离子。因此和离子交换树脂一样，按照其带电荷的种类不同，主要分为阳离子交换膜和阴离子交换膜。阳离子交换膜（简称阳膜）膜体中含有带负电的酸性活性基团，因此它能选择性透过阳离子而阻挡阴离子的透过。阴离子交换膜（简称阴膜）膜体中含有带正电的碱性活性基团，因此它能选择性透过阴离子而阻挡阳离子的透过。

3.2 离子交换膜基过程

3.2.1 电渗析

电渗析是利用离子交换膜对阴阳离子的选择透过性，在直流电场作用下，使阴阳离子发生定向迁移，从而达到电解质溶液的分离、提纯和浓缩的目的。因此，离子交换膜和直流电场是电渗析过程必备的两个条件。电渗析最常见的用途也是最基本的用途是用于水溶液中脱盐和浓缩。此外，电渗析也能用来对食品或化学品进行脱盐或者用来处理纸浆工业的废水等。

3.2.2 双极膜电渗析

双极膜电渗析[17]是一种新型离子交换复合膜，它通常由阳离子交换层（N型膜）和阴离子交换层（P型膜）复合而成，由于阴、阳膜的复合，给这种膜的传质性能带来了很多新的特性。双极膜电渗析过程具有集成度高、节能等优点，但也有不足和缺陷，比如离子交换膜的选择即阻挡同离子透过的能力往往低于100%，而且随着外界浓度的增加选择性还会下降，电流效率还会损失，因此，在进行规模化应用之前需要解决一些技术难题。

3.2.3 倒极电渗析（EDR)

EDR是在直流脉冲电源电渗析和倒极电渗析的基础上发展起来的，在脱盐应用方面具有防止因浓差极化引起的膜堆内部沉淀结垢、减轻粘性物质在膜面上的附着积累、稳定运行周期长等优势。

3.2.4 电去离子技术（EDI)

EDI是近年来在普通电渗析的基础上发展起来的，广泛用于纯水和超纯水的制备。装置与普通电渗析类似：阴阳离子交换膜交替排列在两电极之间，构成不同的隔室（脱盐室或浓缩室），并在其中的一个隔室（淡室）中填充混合树脂。EDI克服了电渗析过程离子含量很低时导电性差和树脂需要不断再生的缺点，可以实现水质的深度脱盐。 此外，还有液膜电渗析、电解电渗析、电离子置换、电离子注射提取等技术。

这些不断发展的电渗析技术已被广泛应用于化学工业、生物工程、环境工业以及食品工业等领域中，前人对此也进行了诸多探索、研究。1984年Y.Prigent和Franco[18]报道了用电渗析和超滤法提取乳酸钠的工作， 1985年钟山、苏初升等[19]人进行了脱氧核苷酸钠溶液电渗析法脱盐的研究并取得了良好的效果。我们在此基础上，运用电渗析法对核苷酸酶解液的脱色进行研究，并在实验的基础上对膜进行优化，以期达到为工业化生产提供理论依据的目的。

四、本文研究的目的和意义

综合上述核苷酸的分离浓缩方法可知，目前传统的核苷酸分离方法，不仅各有缺点，且生产效率不高，难以进行大规模工业化生产。本课题主要针对的是，在离子交换膜的基础上，用电渗析法分离酶解液中核苷酸，通过考察不同类型的阴离子交换膜和阳离子交换膜对电渗析收率和脱色效果的影响，以及酶解液中杂质对核苷酸的电渗析效率和膜污染的影响，进行实验研究，筛选得到较优的离子交换膜，并对核苷酸酶解液电渗析过程进行优化。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1本课题要研究或解决的问题：

核苷酸酶解液中存在无机盐、色素、蛋白质、未完全水解的寡聚核苷酸等杂质，颜色深、粘度大，核苷酸的分离难度大。本课题根据核苷酸和杂质成分理化性质的差异，采用电渗析的方法，提取酶解液中的核苷酸，除去色素、蛋白质等杂质，为后续分离过程提供高纯度的核苷酸混合溶液。

2.2 拟采用的方法