文 献 综 述

1. CRISPR/Cas9系统简介

1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列^[1]，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年科学家将其正式命名为Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR），CRISPR的全称为成簇的、规律间隔的短回文重复序列，(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDel 突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。

2. CRISPR/Cas系统基因组编辑

基因组编辑是先形成位点特异的双链断裂，紧接着通过同源重组（HR）或非同源末端连接机制（NHEJ）进行修复。供体克隆与基因组发生同源重组，引入外源DNA片段，实现基因敲除和敲入；非同源末端连接即染色体末端重新连接。NHEJ易于发生插入或缺失后的移码错误。目前，已成功应用于基因组编辑技术的序列特异性的核酸酶包括锌指核酸酶(zinc-fi nger nuclease，ZFN)、TALEN和CRISPR/Cas，对于CRISPR/Cas而言已发现了三种类型的CRISPR/Cas系统。根据Cas基因序列及蛋白结构，可将CRISPR/Cas系统分为3种类型：I型、II型和III型，每种CRISPR-Cas系统均包含具有核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)基因和决定切割位点特异性的非编码RNA^[1-2] 。 II型CRISPR/Cas系统在发挥功能时只需要一个Cas蛋白即可对DNA链进行切割，因此II型也是目前被成功改造的人工核酸酶。 而I、III型CRISPR/Cas系统较复杂，需要多个Cas蛋白形成复合物才能切割靶DNA链，因此， II型CRISPR/Cas系统比其他两种CRISPR系统更为简便, 因此最适合在基因组编辑中应用^[2-3] 。

CRISPR在 II 型 CRISPR 系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活 crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列。CRISPR/Cas系统编码tracrRNA，tracrRNA指导RNaseIII和crRNA前体的成熟；成熟的crRNA与tracrRNA互补配对形成RNA二聚体，介导Cas9蛋白对靶位点进行切割，造成DNA双链的断裂，引起体内细胞修复机制包括插入/缺失引起的末端连接和同源重组修复机制。插入/缺失机制会造原序列缺少一些碱基或在原序列引入一些碱基，无论何种情况都会引起目的基因突变^[4]，可能使该基因失去功能。而同源重组介导的DNA修复机制，利用CRISPR/Cas系统将DNA双链切断，通过引入的一段与目的基因同源序列进行同源交换以达到修复目的基因。大量实验证明，CRISPR/Cas9是最行之有效的基因编辑工具，已广泛应用于基因组编辑、基因治疗以及转录调控．基因组编辑是对遗传密码实现永久性改变，这一点不同于RNA干扰（RNAi）。RNA干扰可引起基因下调”knockdown”（下调）或”Reduction”（减少），但并不能去除某一基因功能。它可以对任何靶位点后紧随NGG(PAM)的20bp的序列进行定点编辑。但由于受PAM的限制， 该系统不能对基因的任何位置进行编辑。Ⅲ型CRISPR/Cas系统切割，DNA双链不受PAM的限制，靶位点选择时更自由，但需要多个Cas蛋白形成复合体发挥功能，因此，对Ⅲ型CRISPR/Cas系统进行开发在技术和理论层面相比较II 型 CRISPR/Cas系统存在一定的困难，操作步骤相对复杂，开发条件要求较高^[5] 。

3.CRISPR/Cas9 系统特点：

（1）操作简单，靶向精确性更高。sgRNA 靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA的序列不超过100 bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸；

（2）CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传；

（3）基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 ；