1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

1海藻糖

1.1海藻糖的介绍

海藻糖(Trehalose)，是由两个吡喃环葡萄糖分子以α,α-1,1糖苷键连接而成的非还原性双糖,化学名为α-D-吡喃葡糖基α-D-吡葡糖苷。分子式是C12H22O11，分子量为378.33。海藻糖广泛存在于自然界细菌、真菌和动植物体内。自身的化学性质十分稳定，且具有双糖所没有的独特的生物学性质，具有很强的保水作用。此外，海藻糖是一种天然的糖类，无毒无害，对人体无副作用，具有优良的甜味，在食品工业上应用广泛。当生物细胞处于饥饿，干燥，高温等恶劣环境时，海藻糖能够提供能量，并对细胞的生物大分子起到保护作用，从而维持细胞的生命特征。

1.1.2海藻糖的性质

海藻糖的理化性质^[1]

此外，海藻糖还具有令人瞩目的生理功能。当生物细胞处于干燥、饥饿、高温、低温、辐射、冷冻和高渗透压等恶劣环境时，细胞内的海藻糖含量会随之迅速上升，对蛋白质和生物膜等生物大分子进行保护，使得生物体的整体生命体征不受影响。Hottiger等^[2]认为海藻糖对热耐受的保护机制是当蛋白质处于过热状态下，海藻糖会抑制蛋白质由于热应激而产生的凝集现象并且提高热条件下蛋白质的稳定性。

1.2海藻糖的应用

1.2.1在食品行业的应用

在制作蛋糕、饼干、面包时，调节他们的甜味，同时不影响贮藏寿命，也可以降低蛋糕、饼干、面包的脂肪。海藻糖用作糖果的外层可形成一种稳定的非吸湿性保护层，由于海藻糖的稳定性，在长期的保存下，不影响糖果的品质。在水果类制品中，海藻糖是很好的甜味调节剂，并能够使水果制品长期保存。海藻糖的应用将强有力地推动我国食品工业的发展，解决蔬菜、水果、肉类和水产品等农渔产品的加工保鲜和储藏运输问题，使运输成本大幅度下降，并且因食品品质的提高而降低损耗率，促进销量的增加^[3]。

1.2.2在医药工业的应用

海藻糖无毒无害，也可以用作许多医药产品的保存如疫苗、抗血清、细胞等。也可以在冷冻与干燥时保护人工和天然的膜免受破坏，有许多报道提出在贮存液中加入海藻糖，就能在4℃ 条件下保存哺乳动物细胞^[4]。

1.2.3在化妆品中的应用

海藻糖在化妆品上的应用是基于其具有优异的保持细胞活力和生物大分子活性的特性。皮肤细胞，尤其是表皮细胞在高温、高寒、干燥、强紫外线辐射等环境下，极易失去水分发生角质化，甚至死亡脱落使皮肤受损。海藻糖在这种情况下能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，从膜上析出的粘液不仅滋润皮肤细胞，还能将外来的热量辐射出去。

1.2.4在农业方面的应用

海藻糖可用于作物抗寒、抗旱、种子保存等领域。使用海藻糖后，使得种子，种苗的根茎有效的减少水分子的流失，有利于农作物的播种，提高了成活率。海藻糖的使用，减少了北方寒冷干燥的气候对农业的影响。美英科学家已培育出了转基因番茄，并正在研究将海藻糖合成酶基因导入其它水果。将来也许可能用来改善植物特性，用来改造沙漠、绿化荒旱地等^[5]。

1.3海藻糖的生产与制备

海藻糖在自然界中大量存在，但是能够累积海藻糖的物种并没有许多。海藻糖能够面对恶劣的环境并能够产生应激代谢物，当外部环境适宜其生长时，海藻糖迅速溶解，这给海藻糖生产与制备产生了巨大的难题，因此造成了海藻糖价格一直处于居高不下的状态。所以，如何生产出低成本、高效率的海藻糖成为的各行各业的重点问题。现已研究的海藻糖制备方法有提取法，微生物发酵法，酶法生产以及基因重组法这四种方法。

1.3.1提取法

传统的提取法是利用有机溶剂对海藻糖进行提取。提取法操作简便，但是提取成本太高，并且收率低，不适合大规模的生产。邵漪^[6]等在70℃条件下，利用浓度为60～70%的乙醇对活性干酵母进行提取，然后抽滤1-1.5h，得到海藻糖溶液，经过后续处理，获得海藻糖，收率为11g／100g干酵母。

1.3.2微生物发酵法

微生物发酵法是利用产海藻糖菌株进行发酵。从菌株的代谢中分离海藻糖。赵玉巧^[7]对海藻糖啤酒酵母进行优化培养，使得海藻糖的浓度大大增加，达到1072mg／L。微生物发酵法的利用，使得海藻糖的浓度增加，收率也随之增加，但是这种方法离大规模生产还是有一段距离的。

1.3.3 酶合成法

酶法生产海藻糖的方法很多，包括双酶体系跟单酶体系。其中双酶酶系包括磷酸海藻糖合成酶和磷酸海藻糖酯酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶；单酶酶系包括：海藻糖合成酶、海藻糖糖苷转移酶和海藻糖磷酸化酶。其中，关于海藻糖合成酶制备海藻糖的研究是近几年来的热点，其催化的底物为麦芽糖，仅一步催化即可制备海藻糖。将海藻糖合成酶通过分子手段进行异源表达，可获得大量具有高催化效率的酶。在外界环境中将麦芽糖和酶混合，通过催化生产海藻糖，且产物中成分明确，分离工艺相对简单，可有效提高海藻糖得率。韦等^[10]从谷氨酸棒状杆菌中克隆海藻糖合成酶基因，与载体连接后转入大肠杆菌内表达，生产海藻糖合成酶；将海藻糖合成酶10 L加入到100 L 30%的麦芽糖浆或淀粉糖浆中，在25-30℃下催化24-36 h，经产物提纯，100kg木薯可得到40kg海藻糖。

2多酶耦合

生物反应一般是多步连续反应，同时需要多种酶的作用，所以需要多酶共反应^[11]。在多酶级反应的酶与酶之间的传递过程中，由于中间产物不能及时与酶分子结合，从而制约了连续催化反应的效率，当酶分子之间的距离缩短时，就会强化酶与酶之间的传递过程，从而提高酶反应速率。因此，多酶耦合在调控多酶催化反应效率方面具有一定的优势。
2.1.1融合表达

融合表达是指将两种或者两种以上的酶蛋白的基因按照一定的顺序进行连接，形成一个统一阅读框，经转录、翻译后形成一个融合酶蛋白。融合酶可以将多个酶整合在一个杂合蛋白，实现多步催化。Wang等^[12]将海藻糖合成酶与β-淀粉酶进行融合用于催化淀粉直接制备海藻糖，并且研究了两个酶的不同连接顺序对融合酶催化活性的影响，研究表明海藻糖合成酶连接在β-淀粉酶的N端的融合酶的活性更高。但通过融合表达获得的融合酶的多肽上的各个氨基酸残疾之间的相互作用复杂，可能会产生不必要的相互作用，导致结构域的折叠错误，从而破化酶的催化活性。

2.1.2构建人工合成支架

构建人工合成支架是指按照一定的催化顺序锚定目的蛋白，对代谢途径中的各个组件进行模块化控制从而达到在对酶合成体系中的各蛋白水平进行调控的目的。支架的构成形式有蛋白支架，DNA支架及RNA支架。其中DNA支架具有很多优点，DNA具有高度可预测的结构，支架的序列不影响支架体内的稳定性。还有DNA结合蛋白在自然界中大量存在，这些结合蛋白能够高度特异的结合DNA序列，是构建DNA支架的理想材料。Robert等^[13]认为DNA支架的构建能够提高白藜芦醇，1，2-丙二醇，甲羟戊酸等物质合成途径中的酶催化效率。Keasling等^[14]针对在大肠杆菌中构建的甲羟戊酸代谢途径设计了一个蛋白支架组件，该支架由3个不同的配基组成，而在该代谢途径的3个酶上各添加一个相应的配体，通过该支架配体与配基相结合的作用，可以将3个酶同时固定在蛋白支架上，通过这种模式，成功地将目标产物甲羟戊酸的产量提高了77倍，并减少了代谢负荷。但构建的支架也存在错误折叠、容易聚集、容易降解等问题。

2.1.3共固定化

多酶固定化技术是指将多种酶同形成时固定在同一个载体中或将多种酶通过交联的方式形成共交联体的一种技术。Torabi 等^[15]将胆固醇氧化酶 (COD) 和辣根过氧化物酶 (POD) 共价共固定化于珍珠岩表面，研究结果表明，固定化双酶pH 值稳定性高于游离酶,固定化胆固醇氧化酶的热稳定性相比于游离酶提高了2 倍，同时固定化酶具有良好的重复利用率，固定化多酶的稳定性有较大提高。Taboada-Puig 等^[16]以戊二醛作为交联剂共聚集多功能过氧化物酶 (VP) 和葡萄糖氧化酶(GOX)，得到共交联酶聚合体。葡萄糖氧化酶可持续制备过氧化氢 (H2O2)，多功能过氧化物酶可以消除副产物对反应的影响。共固定化也存在着缺点，共固定化酶的活性有不同程度的降低，同时成本较高。

2.1.4通过短肽标签连接偶合

该方法是近些年的研究热点，具体是将短肽标签基因与目的酶基因进行融合，与之相对应得短肽标签与另一个目的酶基因进行融合，经转录表达之后，通过一对短肽之间的相互作用，将两个酶进行连接偶合，从而缩短酶与酶之间的距离，提高多酶催化的效率。短肽标签的种类繁多，例如SNAP标签、Halo标签、SpyTag/SpyCatcher标签^[17]。该方法与融合表达的区别在于，标签蛋白比较小，氨基酸残基数少，与目的酶融合后不会对酶的构象产生影响，从而保持酶的催化活性。通过短肽标签之间的共价结合进行多酶融合，既保证了酶的催化活性，又能够构建稳定的多酶耦合体系，提高多酶催化系统的效率。

3. SpyTag和SpyCatcher

SpyTag和SpyCatcher来源于化脓性链球菌（SPY)的纤连蛋白结合蛋白FbaB ^[18]。FbaB蛋白的结构域CnaB2分裂成13个残基的肽（SpyTag)和116个残基的互补结构域（Spycatcher)。SpyTag和SpyCatcher在温度、pH、缓冲液适宜的条件下自发形成异肽键^[19]。SpyTag和SpyCatcher不含有半胱氨酸残基，功能良好且反应效率高。SpyTag/ SpyCatcher可用于酶的环化，增强酶的稳定性。Meng Si^[20]等将SpyTag和SpyCatcher分别连接在荧光素酶的C、N端，利用SpyTag/ SpyCatcher之间形成不可逆的共价键获得荧光素酶的环化酶，研究表明环化酶在45℃的半衰期是环化前的2.4倍。SpyTag / SpyCatcher还能用于酶的固定化，将SpyTag与大肠杆菌的纤维，再通过SpyCatcher与α-淀粉酶融合后，与SpyTag形成异肽键，固定于生物膜上进行催化反应^[21]。

4本课题研究目的与意义

在现代社会，健康是人们长久以来一直关注的话题，健康功能性食品的发展也越来越受人们的关注。海藻糖作为健康的功能性低聚糖受到人们的青睐。海藻糖具良好的功效，能够给医疗，化妆品行业以及农业等领域带来良好的效益，同时海藻糖是良好的甜味剂，保护剂以及能够改善食品风味的添加剂，所以人们对于海藻糖的需求也在不断增加。但我国对海藻糖的研究起步晚，目前的研究基本集中在利用海藻糖合成酶催化麦芽糖制备海藻糖的工艺，对于直接利用淀粉制备海藻糖的研究甚少，而我国是农业大国，淀粉来源丰富，如果能高效利用淀粉合成海藻糖，就会带动国家的农业发展。本课题研究通过引入短肽标签将海藻糖合成酶与β-淀粉酶进行偶合，开发能够直接催化廉价淀粉高效制备海藻糖的工艺。若能够成功通过淀粉经酶反应一步合成海藻糖，将带来巨大的商业潜力，这也是本课题研究的目的和意义。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1本课题要研究或解决的问题

海藻糖具有保护细胞和细胞内膜、蛋白质等生物大分子在干燥脱水、辐射、高渗等逆境环境下活性免遭破坏的功能，作为一种天然的生物保护物质而大量存在，素有”生命之糖”的美誉。但目前国内对直接利用淀粉制备海藻糖的工艺研究较少，而我国为淀粉生产大国，且淀粉的成本较低，因此，本课题通过引入短肽标签spytag/spycather分别与海藻糖合成酶及β-淀粉酶进行融合，通过短肽标签之间的相互作用进行耦合，研究利用双酶体系直接催化淀粉制备海藻糖的工艺。

2拟采用的研究手段