一、前言

1.1 解脂耶氏酵母简介

解脂耶氏酵母是一种具有生物技术潜力的子囊菌，其细胞形态能够在酵母型、假菌丝型以及菌丝型之间进行相互转换。解脂耶氏酵母可利用的底物广泛，能够用于生产化学物质，如有机酸（柠檬酸盐、异柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、丙酮酸盐和琥珀酸盐），多元醇，类胡萝卜素，烷烃和芳烃。该酵母广泛分布在自然界中，主要是富含脂类和蛋白质的环境中，如地沟油，奶酪，采油井口等^［1］。该研究的目的是探索不同碳源对解脂耶氏酵母的生长性能和产物合成的影响。

二、研究意义

解脂耶氏酵母对生物医学以及生物化工领域有重要意义。它作为一种广泛使用的生物技术”底盘”，其降解底物的能力已通过代谢工程扩大。解脂耶氏酵母是一种被广泛认可的含油酵母，因其在生产油和脂肪酸衍生物化合物方面的优越特性而闻名，是石油在生物燃料和绿色化学生产中的潜在替代品。它的碳源包括很多普通的碳水化合物和脂肪，这也使得它适用于不同的工业应用。在过去的几年，代谢工程方面已经做出了广泛的努力来增加解脂耶氏酵母的脂质含量。目前已经构建的生物工程菌株在葡萄糖上生长时积累高达90%的DCW作为脂肪酸，且表现出高达理论最大值的85%的高产率^［2］。尽管脂质合成的水平高，但其生产成本还没有低到可以使该工艺在生产上有利可图。为了降低成本，有必要探索比葡萄糖更为廉价的底物。但不幸的是，解脂耶氏酵母不能在大多数最容易获得且最廉价的碳源中生长。因此，本项研究旨在找到解脂耶氏酵母的合适碳源，更好实现它的工业应用价值（例如：在污染物处理中的应用，在污水处理中的作用，生物脂质的生产以及柠檬酸的生产等）对解脂耶氏酵母的研究的展开将会带给我们意想不到的发现。

三、研究现状

目前，代谢工程努力的方向是提高解脂耶氏酵母自然降解碳源和开发新型底物的能力。在葡萄糖培养基中，该酵母快速生长且产生大量脂质^[3]。但由于与粮食生产的竞争和市场价格的波动，它不是优选的碳源。又因为解脂耶氏酵母会很高效的自然消耗甘油^［4］，有人认为甘油是一种优选的碳源。事实上甘油是一种有趣的底物，它可以在三酰甘油的生成中作为支架。解脂耶氏酵母在果糖分解代谢中的效率是依赖于菌种的，但果糖的生长速度比葡萄糖培养基的生长速度慢^［5］。研究表明己糖激酶活性是果糖利用的限速步骤^［6］。当使用疏水性底物时，解脂耶氏酵母可以附着到大的脂滴并分泌表面活性剂和乳化剂^［7］。纤维二糖时从富含纤维素的材料中获得的葡萄糖二聚体，木糖时木质纤维素水解液中含糖，但纤维二糖不能作为解脂耶氏酵母的唯一碳源^［8］，木糖也不能作为它的唯一碳源^［9］。这个结果表明解脂耶氏酵母具有所需的基因，但它们没有被充分表达。之后人们希望构建出消耗多糖的菌株，因此解脂耶氏酵母菌株被工程化，表达并分泌水稻 α-淀粉酶和黑曲霉葡糖淀粉酶^［10］。该菌株能够在可溶性淀粉（即液化后）上生长。随后将携带着两个基因的遗传构建体转移到能够积累大量脂质的基因修饰的菌株中，该菌株能够通过固定的生物工艺从淀粉生产生物柴油。木聚糖是包含木糖亚基的多糖，它是木质纤维素材料中最丰富的半纤维素之一，因为它价格低廉所以其作为碳源用于生物技术是理想的。但不幸的是工程菌株在木聚糖上生长的能力差异太大，因此它依然不是我们寻找的合适碳源。解脂耶氏酵母共同消耗木糖和葡萄糖具有优选底物；尽管已经观察到共同消耗葡萄糖和纤维二糖^［11］，但它比甘油优于烷烃和葡萄糖^［4］，葡萄糖优先于木糖和半乳糖^［12］。最近在解脂耶氏酵母中发现了新的转运体系^［8，13］，为以运输目的的新工程战略打开了一扇门，以改善底物吸收。又因为解脂耶氏酵母天然的积累柠檬酸循环中间体的能力和其对酸性pH的耐受性，它被认为是琥珀酸生产的潜在代替者。目前已有研究揭示了SDH阴性解脂耶氏酵母中醋酸溢出的机理，而且还报道了具有较高工业前景的高效琥珀酸生产菌株的发展^［14］。解脂耶氏酵母VKMY-2412从乙醇生产α- 酮戊二酸，随后经一系列化学反应过程转化成琥珀酸。而微生物来源的琥珀酸对致人类和植物的致病微生物具有抗微生物作用^［15］。

四、基本方法

解脂耶氏酵母的基本底物已经使用代谢工程人工扩展，但是这些便宜的底物通常含有不同碳源的混合物。因此，我们的改进应该结合底物的影响以使碳吸收和产物产量最大化。由于改善自然碳源的代谢是一条优选的途径，所以我们主要选择的底物是糖（即单糖、二糖、多糖）和甘油，可以从菌种是否能够利用这种底物，在底物上的生长状况和产量的多少来评价不同碳源对解脂耶氏酵母生长情况的好坏以及对合成产物的影响。

根据现有的研究，温度和pH值是影响解脂耶氏酵母细胞生长和脂质积累的重要因素^［16］。因此，在实验操作上要保证一定的温度和pH值，才能进一步确认解脂耶氏酵母中的细胞生长和脂质积累情况。一般使用激光扫描荧光显微镜（LSCM）进行荧光测试。分批培养的细胞样品10微升尼罗红染色进行测定。对于解脂耶氏酵母培养，使用无菌移液管从分批培养物中定期取出1.5 ml样品。为了描述细胞的生长状况，将细胞浓度作为600 nm处的培养液（OD₆₀₀）的吸光度进行测量。生物量表示为DCW（干细胞重量），以10，000 rpm离心10 min从10 ml培养基收获细胞；用乙醇（95%）和己烷洗涤除去胞外脂肪酸^［17］。并以105℃ 在烘箱中干燥至恒重，然后称重、计算。我们在在选择碳源的时候，也要寻找出每种碳源的最优浓度。