迄今为止，周围神经损伤的治疗手段主要有神经吻合技术、神经移植物、神经导管修复术、基因工程等手段。神经吻合技术虽然手术损伤小、时间短，但两端的神经内容物和特定神经束可能会无法准确对合，导致神经组织增生，因此有一定的局限性。神经移植术包括自体移植、异体移植、异种移植等。自体神经移植能提供轴突生长所需的神经生长因子，免疫排斥反应小，被视为周围神经缺损修复的“金标准”。但对于粗大、长段的周围神经缺损，存在供体神经支配区永久性失神经功能障碍、供移植神经来源局限、受体区神经瘤形成等缺点，无法满足临床需要；异体神经移植提供了神经再生框架，但是面临免疫排斥反应、移植成功率低、感染、肿瘤形成等风险。基因治疗的方法包括直接法和间接法，但都因操作复杂、技术不成熟等原因使用较少。

最近几年来，随着组织工程学这一领域的进步，采用组织工程学的方法构建神经修复导管成为周围神经损伤修复的重要方法之一，在神经修复领域有着广阔的前景，并成为国内外研究的热点。组织神经工程系统主要是利用神经导管(Nerve guidance conduit, NGC）与细胞、因子的协同作用以修复损伤神经。神经导管，它结合了组织工程学的基本原理和制备方法，以神经再生的基本理论为指导，利用生物或非生物材料制成具有特定性能的管状结构，在断损神经两端建立桥接，为神经再生提供适宜的再生微环境，同时通过神经趋化、神经营养等作用使神经轴突沿着管壁从近端向远端生长，从而实现修复周围神经缺损和达到功能重建的目的。因此，本课题拟采用神经导管治疗周围神经损伤。

构建神经导管的方法主要有浇铸成型法、挤出成型法、静电纺丝和3D打印。浇筑成型法简单易行，能人工控制壁厚和导管结构，但可能有残留一定的有机溶剂残留，会对生物体产生不利影响。挤出成型法以其无溶剂加入对生物体无伤害、可大规模生产、尺寸可精密控制、重复性强等诸多优点为研究者们所看重，但缺点是操作较为复杂。3D打印技术能精准设计具有复杂的、高度仿生内部结构和形状的支架，打印出实体模型，能精准的控制支架的结构和几何形状、均匀的分配材料及确定细胞间距的一致性。但此方法对设备及技术要求较高，因此本课题不采用此方法。静电纺丝技术制备的纤维比表面积高，孔隙率大，可模仿天然细胞外基质的结构，在神经组织基体修复中取得了良好的效果，展现出良好的发展前景。因此，本课题拟采用静电纺丝技术制备神经导管。

静电纺丝又称“电纺”，是一种制备聚合物超细纤维的加工方法。静电纺丝的原理如下：聚合物溶液或熔体受到表面张力汇集在喷嘴处形成高分子液滴，在外加电场的诱导下表面聚集大量的电荷，随着电场力的逐渐增加液滴变为锥形，即为泰勒锥；当电场强度增加至临界值，电场力克服流体表面张力从而发生了喷射。射流中的溶剂在空中快速挥发，之后形成纳米级的纤维沉积在接收装置上。由静电纺丝技术制备出的三维多孔纳米纤维支架，具有许多优点，比如高比表面积，纳米或者微米级别的纤维基质结构，这种人工支架模拟天然细胞外基质，都具有足够的孔隙率从而可有效限制瘢痕的浸润，与此同时还可以使营养成分分布和去除支架内的废物。理想的纳米纤维支架生物相容性良好，具有仿生学的结构和生物物理学特性，并且容易植入。

用于神经支架的材料包括生物衍生材料、合成材料、复合材料。生物衍生材料主要有透明质酸、壳聚糖、胶原、天然纤维素等。天然生物材料其生物相容性好，有细胞可识别的生物信号，有利于神经细胞的增殖和迁移。但机械强度不足，且极易被酶分解故降解速率过快，因此通过交联或与其他材料复合使性能得以改善。目前广泛应用于医学领域的合成材料是聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。具有好的生物相容性及可降解性，并且可以通过改变两种材料的比例调节其机械强度和降解速度。PLGA 降解物呈酸性，会影响细胞生长环境。聚己内酯作为导管材料其机械强度的不足，可通过化学改性弥补，改性后有诱导组织再生、调节生长和组织分化的重要性能。合成材料没有细胞识别的生物信号，因此细胞亲和性不足，通过与天然材料复合使其具有更好的生物稳定性和生物相容性。有研究者将 PLGA、丝素、胶原 3 种材料复合，制备的神经导管具有良好的机械强度、柔韧性、生物相容性。对于较大的神经缺损而言，导管材料的柔韧性显得尤为重要，不压迫周围神经的同时还要利于导管与神经外膜缝合，方便手术使用。因此本课题拟完成多种不同材料的电纺处理，并进行多层纺丝层的组装。

2.1 研究（设计)的基本内容

学习静电纺丝制备神经导管的过程，选择出合适的生物材料制备静电纺丝，完成多层不同神经导管之间的组装，完成复合神经导管的表征。

2.2 研究（设计）的目标

通过查阅文献，了解静电纺丝仪器的使用方法，学习静电纺丝制备神经导管的方法，选用合适的生物材料制备多层神经导管，完成多层不同神经导管之间的组装及复合神经导管的表征。

2.3 拟采用的技术方案及措施

2.3.1 复合丝素蛋白神经导管的制备

将 50 g 新鲜蚕丝放于 2000 mL 0.5%的 Na2CO3 溶液中煮沸以脱去外层的丝胶，每次煮沸 30 min，重复 3 次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台内自然晾干，得到脱胶蚕丝。将脱胶后的蚕丝溶解在三元溶剂体系中（无水 CaCl2：无水 C2H5OH：三蒸水=1:2:8）得到黄色透明溶液，溶解温度 73C。溶液置于纤维素管（截留分子量：12-14 KD）内，用三蒸水透析 3 天。透析好的丝素溶液倒于培养皿，放在超净台中鼓风晾干。待晾干后揭下即形成再生丝素膜。将形成的再生丝素膜溶解在 99%的甲酸中形成溶液，采用静电纺丝设备对丝素溶液进行静电纺丝。具体过程如下：将纺丝液装在带不锈钢针头的注射器中，通过微量注射泵往前推进，针头与高压电源正极相连，铝箔作为接收装置，与负极相连，接收装置与注射器的针头保持一定的距离。在电场作用下，针头处的液滴克服表面张力形成射流，喷射过程中，溶剂挥发，丝素蛋白被快速拉伸成微纳米纤维沉积在锡箔纸上。实验过程中按表 1 列的设计方案变换纺丝参数，扫描电子显微镜（SEM）观察纤维形貌，确定最佳工艺条件。

表1 静电纺丝的参数

取 2 g 的丝素溶液，按上面优化好的条件进行纺丝，用往返移动的旋转（v = 500 rpm）的圆柱形金属棒（d=5 mm）作为接收装置。收集一层丝素蛋白纳米纤维后，将金属棒和丝素膜一起取下，用编织机在丝素膜上编织一层脱过胶的丝素纤维网，然后以带膜、带网的金属棒继续作为收集装置，用相同量的丝素溶液静电纺丝，获得导管的外层。乙醇处理，得到具有复合结构的丝素蛋白神经导管。

2.3.2 PLGA神经导管的制备

称取一定质量的 PLGA于25 mL 烧杯中，加入 DMF 和 THF（体积比为 1:1），在恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，配制质量分数为 22%的溶液。 将纺丝溶液注入5 mL 注射器中，将注射器针头磨平并与高压电源输出端相连，调整纺丝电压大小为 20 KV。把注射器固定在注射泵上，流速设为 2.4 mL/h。接收装置为带有铝箔的旋转滚筒，针头与接收装置间距离为 18 cm，滚筒转速在 1800 ~2000 rpm 之间，纺丝时间约 1 h。

将几种不同比例的 PLGA 取向纤维膜取下，裁剪成 3.5×2 mm，在直径 1.6 mm 钢针上按 LA 组分比例增长的顺序层层卷绕，再置于磷酸盐缓冲液中静置 1 min，抽去钢针，干燥灭菌包装，即可得所述神经导管。

2.3.3 NGF 电纺纤维神经导管的制备

称取 250mg PLLA，溶于 0.7 mL 二氯甲烷中，待 PLLA 完全溶解后再加

入 0.3 mL N，N- 二甲基甲酰胺，作为外油相。称取适量 NGF 冻干粉，加入 0.1 %的牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 缓冲液中，涡旋3 min 使 NGF 溶解均匀，作为内水相。将内水相逐滴加入外油相中，采用磁力搅拌器搅拌 30min，形成 W/O 乳液。

用注射器吸取乳液，固定于静电纺丝装置的推注泵上，开启高压电源，进行静电纺丝，得到 NGF 纤维。将制备好的纤维膜取下，裁剪成适当的大小卷在直径为5mm的不锈钢圆棒上，用SEM观察导管的形貌。

2.3.4 PHBV神经导管的制备

将一定浓度的溶液加入到一个安装有号针头的玻璃注射器中,把注射器固定在推进泵上,在注射器针头上施加直流高压即可使溶液细流喷射出来。采用包覆有铝箔的接收屏收集无序纤维由旋转的卷绕筒接收有序纤维。直流电压控制在5-22kv之间,PHBV溶液的流量由推进泵控制,流量为0.3-0.5ml/l，针头与铝箔之间的距离为10-25cm。

采用锭子式编织机将前面制备的单丝编织成网状导管,锭子数为6、8、12、16,内芯材料为不锈钢丝,不锈钢丝的直径分别为1.5mm、2mm、3mm、4mm。编织过程中的编织角为60`。将编织好的网状导管在50℃下热定型小时以消除纺丝以及编织过程中形成的内应力,进而使导管定型。

将纺出的有序纤维膜以直径分别为1.5mm、2mm、3mm、4mm的芯棒卷绕成内管,纤维排列方向平行于芯棒的轴向方向。将中编织好的中间层网状导管按照相同的直径套入带内管的芯棒上,将芯棒两端的内管和中间层导管固定好,然后将芯棒固定在静电纺丝旋转接收装置的卡盘上。最后用配制好的浓度为6%的PHBV溶液进行静电纺丝,用芯棒接收直接纺出导管,芯棒的卷绕速度为2400rpm。

2.3.5 石墨烯／聚乳酸(Gr／PLLA)复合神经导管的制备

配制浓度为0．5 mg／mL的Gr悬浮液，并进行超声处理，每隔0．5 h测定其电导率．当超声时间达到3 h时，其电导率基本达到稳定状态．对超声3 h的Gr用透射电子显微镜(TEM)进行观察，发现其为寡层结构．因此可以认为3 h为最佳超声时间．

将超声分散的Gr按照0，0．1％，0．5％和l％(质量分数)的比例分别加入到5％(质量分数)的PLLA／PEO纺丝液中(PLLA与PEO质量比为4：1，PEO分子量为Mw1，溶剂为三氟乙醇)，充分搅拌过夜后进行SJES电纺丝．将PEO的分子量换成Mw2，按照传统静电纺丝方法制备不含石墨烯的半取向PuA纤维作为对照．静电纺丝参数：电压6—7 kV；接收距离19 em；滚筒转速1000 r／min；注射速率l mL／h；环境湿度：40％一60％；环境温度：18—25℃

将纤维沿一定方向卷绕在直径为5mm的不锈钢圆棒上，于55 ℃下热处理15 min．用SEM观察导管的形貌。将40止含有5×104个细胞的SCs悬液注射到长度为5 mm的神经导管中，置于含有培养基的24孑L板中进行培养，用CCK一8试剂盒检测细胞增殖情况，测试前需将导管转移到新的孔板中，以去除孔板中残留细胞的影响

2.3.6 神经导管的表征

1. 厚度测定

选取 5 个样本，用游标卡尺测定导管管壁厚度，求其平均值。

2. 神经导管的扫描电镜观察（SEM）

使用电子扫描显微镜（SEM）观察静电纺丝纤维膜的微观形貌。将不同材料电纺出的纤维膜剪取一小块，喷金后在扫描电镜下观察其微观形貌，拍摄照片。用图像分析软件 Image J 测量照片上纤维的直径，每个样品测量 100 根纤维。

3. 拉伸性能测试

将不同转速下制备的静电纺丝PHBV薄膜制成8x1cm的样品,用测厚仪测其厚度,量5个点取其平均值。在微机控制电子万能试验机上测试其应力一应变关系进而得到样品的抗拉强度、弹性模量和断裂伸长率。每个转速的样品测三个值取平均值。抗拉强度的计算公式为:

4. 孔隙率的测定

将不同材料的管状支架沿径向剪开铺平，测量其长、宽、厚，计算其体积 V，同时测量样品干重m，精确到 0.1 mg。利用测得的体积Vi和干重mi，计算样本的密度 ρi。平行测三组，得平均表观密度ρ。选择样品的表观密度ρ和材料的标准密度ρ0，按以下公式计算样本的孔隙率ε

5. 吸水性的测定

将干燥过的导管，在电子天平上精确测重得#119898;d，然后在去离子水中浸泡 24 小时后取出，用滤纸吸去样品表面和边缘的水后称重得湿态重量#119898;w。按下式计算吸水率：

6. 降解性能的测定

选取一定数量的原料和导管称量，记为原料和导管降解的原始质量；之后取10 mL 的玻璃试管，洗净烘干后待用。将降解前的导管和原料放入试管中，倒入等量 PBS 溶液并做好相应标记，余下三组作为空白对照组，将试管放入 37 °C 恒温水浴锅，之后每过一周取出一批试管，测量液体的 p H 值并记录数据。将原料和导管取出用去离子水清洗，滤干表面水分，真空干燥至恒重后称量。以后每过一周取一组导管，同上述方法测出缓冲液的 pH 值和质量。由于降解过程中样品会逐渐发生降解，导致 pH 值发生变化，我们需要按照一定的周期更换培养液，既可以模拟生物体内环境，又能对样品降解过程中 pH 的变化有一定程度上的反应，材料的失重率按照公式计算：

降解行为的表征：将导管浸泡在 PBS 中，分别在 4 周、8 周、12 周后取出，去离子水冲洗，恒温干燥后，剪取一小块喷金并置于扫描电镜下观察导管管壁横截面和表面纤维的微观形貌并拍摄 SEM 照片。原料降解时每周取出，通过拍摄数码照片来显示其降解过程中形貌的改变。

第 1 － 2 周：查阅相关文献资料，明确研究内容，拟定试验条件。确定方案，完成开题报告。

第 3 － 11 周：多层神经导管的电纺制备与表征。

第 12 周：实验现象分析及实验数据处理。

第 13 － 14 周：完成并修改毕业论文。

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