摘 要

纳米胶束的响应性对于药物传递具有重要意义。本文通过荧光桃红B与氨基乙酸在室温下进行酯化反应后，再与海藻酸钠在水溶液中进行酰胺化获得了两亲性的海藻酸衍生物，并通过紫外吸收光谱，红外吸收光谱和核磁共振的方法表征了海藻酸衍生物结构，通过紫外分光光度法测定了合成的海藻酸衍生物的取代度为0.15；随后在缓冲溶液中通过超声自组装制得了对谷胱甘肽（GSH）敏感的纳米胶束，并通过动态光散射表征了所制得的胶束的GSH响应性。结果显示该纳米胶束在毫摩尔级的GSH溶液中，平均粒径从232nm增加到687nm，表明制得的纳米胶束对于环境中GSH敏感。

关键词：海藻酸，光活化农药，GSH响应性，荧光桃红B

Abstract

The responsiveness of nanomicelles is important for drug delivery. Amphiphilic alginic acid derivatives were obtained by esterification of fluorescent peach red B with aminoacetic acid at room temperature and amidation with sodium alginate in aqueous solution. The structure of alginic acid derivatives was characterized by ultraviolet absorption spectra, infrared absorption spectra and nuclear magnetic resonance. The degree of substitution of synthetic alginic acid derivatives was determined by ultraviolet spectrophotometry. Subsequently, glutathione (GSH) sensitive nanomicelles were prepared by ultrasound self-assembly in buffer solution, and their GSH responsiveness was characterized by dynamic light scattering. The results showed that the average particle size of the nanomicelles increased from 232 to 687 nm in nanomolar GSH solution, indicating that the prepared nanomicelles showed sensitivity to GSH in the environment.

Key words: Alginic acid；GSH Response；Photoactivated pesticide；phloxineB

目录

第1章 绪论 1

1.1光活化农药的概述 1

1.2聚合物纳米胶束的概述 3

1.3海藻酸盐的概述 4

1.4 GSH响应性的概述 5

1.5 本文的主要内容与基本思想 5

第2章 GSH刺激响应性光活化纳米农药的制备与表征 7

2.1引言 7

2.2实验部分 8

2.2.1 实验试剂及仪器 8

2.2.2 海藻酸衍生物（PB-Gly-Alg）的制备 9

2.2.3 PB-Gly-Alg的红外表征 9

2.2.4 PB-Gly-Alg的核磁表征 10

2.2.5海藻酸衍生物紫外吸收光谱及取代度的测定 10

2.2.6 PB-Gly-Alg基纳米胶束的制备 11

2.2.7 PB-Gly-Alg纳米胶束的DLS表征与其对于GSH的响应性研究 11

2.3 结果与讨论 12

2.3.1 海藻酸衍生物（PB-Gly-Alg）的制备 12

2.3.2 PB-Gly-Alg的紫外吸收光谱和取代度 13

2.2.4 红外吸收光谱解析 15

2.2.5 核磁谱的解析 17

2.2.6 PB-Gly-Alg纳米胶束的DLS表征与对于GSH的响应性的研究 17

第3章结论 19

参考文献 20

致 谢 22

第1章 绪论

随着世界人口的增长，对粮食的需求量也越来越大，也导致了农业领域面临较大的挑战，农业生产主要通过加大基础物质如化肥、农药的投入来提高粮食产量。虽然农药在维护人类的粮食安全中做出了重要贡献，但是农药的长期使用也导致了一系列的负面作用如对环境造成的污染、害虫产生抗药性、生态破坏等，这也成为了人们迫切需要解决的重要问题。而在对农药的研究过程中，发现传统农药在使用的过程中往往存在着利用率低，环境污染大等问题^[1]，而缓控释农药对于延长农药持续时间，减少用量与使用频率方面有一定作用，所以缓控释农药近年来受到了人们的关注。同时光活化农药是近几年来发展较快的一类新型、高效、低毒的农药。这类农药本质上是一类光敏剂。其杀灭害虫或杂草的原理为光动力作用,即光敏剂在光照的条件下,吸光（一般为可见光）催化周围的氧分子从而产生高活性的单线态氧或超氧负离子，从而杀灭害虫或杂草^[2]，由于其目标靶点多，所以害虫和杂草对其的抗性发展较为缓慢，同时其发挥作用的机制正好是其自然降解的机制，导致其对于环境的污染较小，但由于其在自然环境中降解过程较快，导致目前对其的应用较少。而智能聚合物纳米胶束作为一种能对外界刺激（包括pH、温度，光等）做出形态或结构改变的微粒^[3]，其对于传统的药物释放系统相比具有很多独特的优势，如能保持药物的活性，聚合物胶束能为药物分子提供输送到靶点的载体，能有效避免光敏剂在进入害虫组织细胞之前被光解。本课题立足于这一方面，针对缓控释农药的载体进行合成与研究，使之能提高农药对环境的智能响应性，从而提高利用率，并减少对环境的污染。本课题计划使用一种新型、高效、低毒的光活化杀虫剂，设计构建一种GSH响应性控释农药制剂。设计用甘氨酸作为连接臂，先利用甘氨酸的羧基与光活化杀虫剂荧光桃红B的酚羟基酯化，再利用其氨基与海藻酸钠酰胺化，两步反应得到两亲性大分子共轭物PB-Gly-Alg。通过超声原位自组装在水溶液中形成Alg为壳、PB基团为核的纳米胶束。将光活化杀虫剂包埋于胶束内部，从而降低了光活化农药的光解，从而减少了农药的流失。当纳米胶束进入到害虫体内，并进入害虫细胞后，暴露于还原性的GSH环境中，酚羟基酯键就会被劈开，胶束就会解体，同时偶联的光活化农药就会释放出来。当害虫暴露于太阳光下，光活化农药就会被激活，导致害虫死亡。

1.1光活化农药的概述

光活化农药是一种可以利用农作物的生长环境中各种环境因素，如光照，氧气含量等激发农药发挥作用，并通过其他辅助条件来提高生物活性的一类光敏剂。这类光敏剂可以在光照和氧分子存在的条件下，对病毒，细胞，乃至生物体起到一定的控制作用，或能在该条件下诱发生物分子发生化学反应，增加或减弱该生物分子的生物活性。同时，光敏剂作用方式为自由基的有关过程和光敏氧化反应，光敏剂本身不介入毒性反应。如果将其作为农药，可用来进行防治病虫害，故通常称为光活化农药。光活化农药的作用机理可分为两种。第一种是光诱发毒性，如呋喃色酮，呋喃喹啉碱等就为此种作用^[4]。这类化合物作用机理为该类化合物首先通过渗透作用进入到细胞内，然后在光照下激活与细胞核和细胞器进行反应，与DNA形成共价化合物，从而干扰了DNA的复制及RNA的转录，该反应不需要氧的参与，可以直接进行反应从而发挥作用。另外一类作用机理为光动力学反应，同时该类机理更为常见。其作用机理为首先光敏剂吸收光后，发生跃迁进入单线激发态，又经系间窜越生成激发三线态，在激发三线态将会发生两种反应。一种为其直接与目标底物反应（如tRNA，DNA等），通过电子或氢原子传递而产生自由基或自由基离子，所得到的自由基和自由基离子再与氧气作用产生超氧负离子，这一过程称为Ⅰ型机制。另一种反应为激发三线态的光敏剂直接与氧气反应生成单线态氧，而单线态氧以生物膜为目标，引起生物膜上化合物（如脂肪酸，游离氨基酸，蛋白质中氨基酸残基等的氧化）这种反应称为Ⅱ型作用机制。这两种作用机制往往同时存在，具体发生那种反应与氧气浓度，光敏剂的反应性，底物等因素相关。

目前，通过人们对几百种光化学农药的研究，将光化学农药分为了两大类，分别为天然源光敏毒素与合成光敏毒素^[5]，本文所使用的荧光桃红B即为合成光敏毒素类中的染料类光敏毒素，该类光敏剂主要是呫吨类染料，其中最有效的是含有卤素的化合物。由于光活化农药本身的性质，其似乎有成为一种高效，无毒，无污染的绿色农药的前景。首先，其环境相容性好，其发挥作用的过程也是其降解过程，因此其在提高药效的同时也减少了环境中的持久残留。其次，其具有较好的选择性，其只对目标生物毒性较强，对非目标生物的毒性极低，如其对人类的安全性为马拉硫磷的10万倍^[4]。再次，由于其作用位点多，所以害虫对其抗性发展缓慢，也因为这种特殊的作用方式，使其不与传统农药之间产生交互抗性。最后，它还具有高效的特点，由于光敏剂本身起催化作用而不介入毒性反应，而以生成的活性氧起作用。故一个光敏剂分子可以产生很多个活性氧分子从而作用于很多个靶标分子，相对于一个分子破坏一个靶标分子的传统农药，其效率已经大大提高。因此光活化农药在近年来也收到关注。

荧光桃红B是一种卤代呫吨类的染料，在1900年，Raab首先报导卤代呫吨类染料有致毒作用，其致毒过程主要由光催化所引发的光致荧光作用，具体为在光敏性染料与分子氧的存在下，化合物性质发生改变从而引发生物体、细胞等的致死和受损伤。荧光桃红B作为一种卤代呫吨类的染料^[10]，其作用机制与上述的过程相同。同时，因为其起作用的机制与其降解的机制相同，所以在自然环境中，荧光桃红B很容易快速降解，所以其残留在自然环境中持续时间很短。荧光桃红B具有很强的水溶性，其水溶液在阳光下的局先的不是降解而是冲洗掉植物沉淀。在阳光状态下，其在水溶液中的半衰期会受到染料浓度、水的性质和光在水中的强度所影响，大致为0.5小时，其光解半衰期表现为数分钟到数小时之间^[1]。而其在植物组织或土壤中的半衰期也少于一个星期，也正是因为其的半衰期较短，所以也保证了其对环境质量不会造成威胁。荧光桃红B与大多数常规农药不同，其呈现出非选择毒性^[11]。其激活后，能对大部分细胞组分包括氨基酸、蛋白质、嘧啶、核酸、膜、脂肪酸、反应化学中间体等起反应，很多生物包括病毒细胞，微生物，高级植物与高级动物可能都含有靶标部位。但荧光桃红B对于不同物种的急性毒性差别很大，其对于人类，哺乳动物和鸟类等的急性毒性很低但对与杂草水生的无脊椎动物毒性较高。由于荧光桃红B在环境中易分解^[12]，导致对其的研究和报道相对较少，而在有关于荧光桃红B的研究表明，对于荧光桃红B的抗性为遗传共显特性而非性遗传。同时荧光桃红B不呈现对DDT，氯菊酯或敌敌畏等农药的交叉抗性，但对玫瑰红等其他卤代呫吨类染料呈现出交叉抗性。同时，由于其靶标较多较为复杂，在实验室条件下，难以观察到荧光桃红B的抗性发展，所以可以认为其抗性发展缓慢。虽然荧光桃红B具有很好的农药性能，但其在光照下的快速降解严重影响甚至限制了其在于农药方面的应用。本文尝试通过前药原理将荧光桃红B保护起来，在特定的环境中再将其释放出来，从而减少其在发挥作用之前的降解，进而扩大其的应用范围减少其使用的限制。

1.2聚合物纳米胶束的概述

纳米技术是一种新兴的技术，其含义在于可以在纳米尺寸范围内对自然进行认识和改造，并通过直接操作和安排原子、分子，从而创造新物质。同时由于物理尺度上的缩小，物质的性质也会发生奇妙的改变。随着纳米技术的发展，其涉及的领域也越来越多，而现在纳米技术在药学领域中得到了应用。在20世纪就通过利用同时具有亲水基团和疏水基团的一种两亲性嵌段聚合物，将其溶于水溶液中自组装制备得到了纳米胶束。对于两亲性聚合物而言，当水溶液中的两亲性聚合物浓度达到一定值时，聚合物就可以自组装成为纳米胶束，这个时候的聚合物浓度称为临界聚集浓度或临界胶束浓度，也可以通过这两个值来表征胶束的情况^[10]。由聚合物所形成的纳米胶束具有载药量高、范围广、稳定性好等优点，正是因为这些优点，使得纳米胶束在药物载体方面与中药制剂方面具有广阔的应用前景。现在纳米胶束的制备方法主要有3种：直接溶解、透析法、自组装溶剂蒸发。而具体选择的方法主要由聚合物在水中的溶解性来决定。载药纳米胶束在形成的过程中，可以通过物理、化学结合和静电作用来包埋药物。纳米胶束在作为药物载体时，可以通过负载难溶性的药物，作为难溶性药物的载体，而增加其在溶剂中的溶解情况，同时，也可以作为靶向给药的载体，由于纳米胶束的相对分子质量一般较大，可以避免被肾排泄，也可以通过亲水性且柔韧的外壳避免被网状内皮系统所识别和摄取，当然，也可以在制备胶束时，设计胶束表面情况，通过胶束表面进行修饰使表面的化学结构可以与特定的抗体或配体相结合，从而做到体美的特异性靶向，也可以利用胶束对于温度或其他因素的敏感性，来实现胶束对于特定环境的敏感性^[3]。同时，纳米胶束可以作为基因药物或者蛋白质药物的载体，通过在生物体内特定环境进行降解，从而避免在体内运输过程中药物的损耗。在中药的制剂领域，将纳米胶束应用于中药中的有效成分，来帮助中药剂型的改良，同时也有利于提高中药的疗效，可以帮助中药的现代化。本文利用两亲性的海藻酸衍生物，使其在水中形成了纳米胶束体系，并对其对于环境的响应性进行了研究。

1.3海藻酸盐的概述

海藻酸是从海藻中提取出来的一种多聚糖醛酸。由M糖(β-D-甘露糖醛酸)和G糖(α-L-古罗糖醛酸)通过1,4-糖苷键连接，并由比例不同的GG、MM和GM片段所组成的线性共聚物^[6]，分子式为，相对分子质量在32000-200000之间。海藻酸易于金属阳离子结合生成海藻酸盐，也常被称为海藻胶或藻胶。海藻酸盐通常指的是海藻酸钠，其余海藻酸盐的主要类型还有海藻酸钙与海藻酸钾。海藻酸盐在自然界中的存在十分广泛，同时其极易从海藻等海产品中提取，同时我国的海藻资源非常丰富，海藻多糖也具有广阔的应用领域，所以目前海藻酸盐的商业产品大都提取自藻类，具体流程为将带有钠离子，镁离子等离子的非水溶性海藻酸盐进行酸化后，即可得到海藻酸，再将所得到的海藻酸加入到氢氧化钠或碳酸钠溶液中中和，将得到水溶性的海藻酸钠，再经过一系列的除杂过程即可得到所需的海藻酸盐，该过程反应了海藻酸相对可以较为方便的获取。海藻酸盐具有较好的水溶性，其水溶液在pH6-11时稳定性良好，且具有较好的糊化与持水性能，但海藻酸盐不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂。同时海藻酸具有较好的生物相容性、可降解性、较好的水溶性等优良性能，现已经被广泛的用于食品，医药，纺织，造纸，日用化工等领域中，并常常作为胶凝剂，增稠剂，乳化剂等应用在各个领域^[7]。在食品、医药、纺织领域也是海藻酸钠最大的三个应用领域。但由于干燥的海藻酸因其存在于分子内的酸而容易催化降解，在常温下的稳定性非常有限，所以常将其保存在干燥阴凉处或将其冷冻储存。海藻酸盐是由甘露糖醛基与古罗糖醛酸残基构成的，其分子量依赖于海藻的来源与提取条件，故而海藻酸盐的分子量呈现多分散性，而这种分散性对海藻酸盐的应用也具有一定意义。在生物医药领域中，利用经过一定的改性的海藻酸水凝胶，可以用作填充材料，细胞移植载体，药物传输控制系统等，特别是在药物传输材料中，可通过海藻酸盐凝胶包埋低分子量的药物，从而实现药物分子的缓释。本文尝试利用海藻酸中反应活性较高的游离羧基，将其与氨基进行酰胺化，从而实现海藻酸与药物分子的结合^[8]。

1.4 GSH响应性的概述

谷胱甘肽（GSH）是一种广泛存在于动植物细胞内的一种还原性物质。在细胞内部的浓度均为毫摩尔级，而在这个浓度范围内，其可以断裂聚合物或者纳米粒子之间的二硫键或者酯键等，使聚合物和纳米粒子获得对氧化还原的敏感性。有研究表明，肿瘤细胞内的GSH浓度范围在2-10mM，而细胞外环境中的GSH浓度范围为2-10µM，可以看到肿瘤细胞内的GSH浓度显著高于细胞外环境^[13]。所以有研究尝试通过构建含有可降解的二硫键的自组装胶束或含有二硫化物的聚合物来实现药物对于肿瘤细胞的靶向释放^[14]。对于GSH敏感的共价键可以构建在胶束的壳或者胶束的芯中。例如Cheng等人使用氧化还原响应型纳米蛋白胶囊演示了p53蛋白的成功递送^[16]。该研究表明可以利用细胞内外的GSH的浓度差来实现药物的靶向释放。所以近年来，对于GSH响应特点的药物传递系统载体的相关研究发展迅速，例如有通过羧甲基壳聚糖的二硫键交联从而得到对于谷胱甘肽敏感的凝胶，该种凝胶对于具有不同GSH浓度的环境做出不同的溶胀行为，该研究同样证明GSH响应可以用于药物的控释释放。本文立足于此，尝试通过利用细胞内外不同的GSH浓度，控制酯键的断裂，从而实现药物对于谷胱甘肽敏感。

1.5 本文的主要内容与基本思想

本文的主要思想是构建一种具有GSH响应性的纳米农药传递系统用于光活化农药在害虫体内的控制释放。海藻酸（Alg）具有良好的生物相容性和可降解性，因此选择海藻酸作为基质。而酚羟基酯键在毫摩尔级GSH的作用下断开，故选择其作为释药开关。亲水性的荧光桃红B（PB）的钠盐在水溶液中可以先通过酚羟基酯键与氨基乙酸（Gly）连接，再通过氨基乙酸的氨基通过酰胺键耦合到海藻酸分子链上，从而形成亲水性大分子前体农药，而后在弱酸性的溶液中以沉淀的形式析出。同时使亲水性的PB基团转化为疏水的基团，从而形成了两亲性的大分子共轭物（PB-Gly-Alg），最后在水溶液中自组装而形成以PB基团为核的纳米胶束。由于被偶连的光活化农药在到达害虫体内之前可以被亲水的海藻酸的壳很好的保护起来，不仅可以降低光分解，而且不会泄露。而只要纳米胶束进入到了害虫体内，并通过细胞的内吞作用进入到害虫细胞内而暴露于还原性的GSH环境中，其中的酚羟基酯键就会被断开，胶束解体，同时偶联的光活化农药（荧光桃红B）就会被释放出来。而此状态下的害虫若暴露在太阳光下，其体内的光活化农药就会被激活，进而导致害虫的死亡。由于本文设计使用的农药为低毒或无毒的光活化染料，且通过酯键连接到了可生物降解的海藻酸分子链上。本文的主要研究内容如下：

（1）两亲性耦合PB的海藻酸衍生物（PB-Gly-Alg）的合成与表征；