摘 要

通过分析薯蓣类中药材的ITS2（internal transcribed spacer 2）与psbA-trnH条形码序列，探讨薯蓣类中药材鉴定的新方法。对22份样品进行DNA提取、PCR 扩增ITS2序列与psbA-trnH序列并进行双向测序，所得序列经CodonCode Aligner拼接剪切后，采用MEGA5.1软件进行序列对比分析，计算其种内及种间遗传距离（K2P），构建邻接树（neighbor-joing Tree,NJ Tree）。结果表明，无论是盾叶薯蓣、穿龙薯蓣、日本薯蓣还是参薯、木薯、黄独之间的种内变异均小于种间变异，NJ树结果显示盾叶薯蓣、穿龙薯蓣、日本薯蓣及其混伪品均单独聚为一支，表现出良好的单系性。说明利用psbA-trnH序列可以较好的区分薯蓣及其混伪品，可用于鉴定薯蓣类中药材。

关键词：DNA条形码；物种鉴定；ITS2序列；psbA-trnH序列；薯蓣类中药材

Abstract

By analyzing the ITS2 (internal transcribed spacer 2) and psbA-trnH barcode sequences of Dioscorea zingiberensis, this paper explores a new method for identification of Dioscorea zingiberensis. DNA was extracted from 22 samples. The ITS2 sequence was amplified by PCR and the sequence of psbA-trnH was sequenced. The sequence was analyzed by CodonCode Aligner. The sequence was analyzed by MEGA5.1 software. Genetic distance (K2P), the construction of adjacent tree (neighbor-joing Tree, NJ Tree). The results showed that the intraspecific variation of Dioscorea zingiberensis C.H.Wright, Dioscorea nipponica Makino and Dioscorea japonica Thunb was less than that of interspecific variation. The results of NJ tree showed that Dioscorea zingiberensis C.H.Wright, Dioscorea nipponica Makino and Dioscorea japonica Thunb were clustered into one and showed good monophyletic. Indicating that the use of psbA-trnH sequence can be a better distinction between Dioscorea and its mixed products, can be used to identify Dioscorea Chinese herbal medicines.

Key words：DNA barcoding;species identification;ITS2;psbA-trnH;Dioscorea of Chinese herbal medicine

目 录

1.1 DNA条形码技术 1

1.1.1 DNA条形码技术研究历程 1

1.1.2 DNA条形码技术的特点及优势 1

1.1.3 DNA条形码技术在薯蓣类中药材鉴定中的应用 2

1.2 薯蓣类中药材国内研究现状 4

1.3 目的及意义 4

1.4 研究内容 5

1.5 研究目标 6

2.1 实验原理 7

2.1.1 实验的基本原理 7

2.1.2 DNA检测 7

2.1.3 DNA扩增原理 7

2.1.4 测序原理 8

2.2 实验材料及仪器 8

2.2.1 实验材料 8

2.3 实验步骤 12

2.3.1 DNA的提取 12

2.3.2 样品DNA的保存 13

2.3.3 DNA纯度检测 13

2.3.4 PCR扩增 14

2.3.5 凝胶电泳检测 15

2.3.6 测序 15

2.4 数据处理 15

2.4.1 薯蓣类药材种内序列特征分析 15

2.4.2 薯蓣类药材种内序列特征分析 18

2.4.3 薯蓣类中药材NJ树图分析 18

第3章：结论 19

参考文献 20

致谢 22

第1章 绪论

1.1 DNA条形码技术

DNA条形码(DNAbarcoding)技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。以标准化、普遍性和效率为特征的生物技术DNA条形码，被广泛应用于生物学，环境科学，法医学取证和跨学科检查等多个学科。DNA条形码技术可能有望实现快速准确的物种识别和可持续利用生物资源的目标。

1.1.1 DNA条形码技术研究历程

DNA条形码的概念首次被提出是在1993年，Arnot等人在根据数字条形码在商品中的应用中提出了DNA条形码的概念^[1]。2002年，Tautz^[1]等人利用不同物种间DNA序列之间的差异，建立了一个识别信息体系，对不同物种进行鉴别，并实现与序列之间的一一对应关系。2003年，由加拿大动物学家Pual Hebert提出，Pual Hebert等对动物界包括脊椎动物与无脊椎动物的超过10000个物种的线粒体进行研究，通过对线粒体细胞色素C氧化酶亚基1进行基因序列比对，发现98%的遗传物种种间差异为0%-2%^[2-3]，因此假设可以用一小段物种的片段基因来代表物种，而我们只需要鉴定物种某一片段的基因再进行比对。但是此方法鉴定时要求物种的种间遗传距离小于2%，而种间遗传距离为种内遗传距离10倍以上。因此，COI片段不适合用于植物的鉴定。于是，科学家们开始筛选适合用于植物鉴定的通用条形码，这是DNA barcoding技术发展的巨大转折点。

2005年，陈士林团队开始对药用植物通用条形码进行筛选，通过对rbcL、matK、psbA-trnH和ITS这4个序列片段进行综合分析，得出ITS片段的鉴定率显著高于rbcL matK。物种水平的分辨率甚至高达92.7%，同时也适用于存在有DNA降解情况的中药材等的鉴定；叶绿体基因组分析发现，psbA-trnH的物种鉴定效率最高，高达67.7%。鉴于以上研究，陈士林等首次提出了ITS2序列为主，psbA-trnH序列为辅的药用植物和中药材DNA条形码鉴定体系^[4]。

2009年，国际生命条形码联盟植物工作组（CBOL）开展了大量的研究项目，从四个方面分析了DNA条形码技术中会遇到的科学问题，初步确定并推荐使用叶绿体基因片段的rbcL和matK^[5]作为植物鉴定的DNA条形码通用片段，但rbcL matK用于科内属间物种鉴定率较高，对属内物种间的鉴定率较低，紧接着，psbA-trnH和ITS/ITS2被列为rbcL matK这对组合序列的补充序列。

1.1.2 DNA条形码技术的特点及优势

理想的DNA条形码应当符合下列标准^[6]：