摘 要

以鲟鱼软骨为原料，采用稀碱与酶解相结合的方法提取硫酸软骨素。在稀碱进行碱提取的基础上，用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组成的双酶分解去除杂蛋白，经无水乙醇沉淀并干燥后得到产品。首先，通过单因素实验确定了各要素的范围，再使用Box-Behnken中心组合实验方法创建提取工艺的数学模型，并对各要素与提纯出的产物进行响应面分析。得到的最优碱提取工艺为：料液比1:7，碱液浓度为4％，碱提温度为37℃，碱提取时间3h。碱提取部分回归方程为：Y₁=40.54-2.31A 1.33B 1.31C 1.25D-2.71AB 1.11AC

2.79AD 5.65BC 0.17BD 2.85CD-0.38A² 4.89B²-2.03C²-1.77D²。最优酶提取工艺为：木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的用量都为2％，酶提温度31℃，酶提取时间3h。酶提取部分回归方程为：Y₂=43.6-0.98A-0.49B 1.36C 0.4AB-0.9AC-1.02BC 0.038A²-1.09B²-1.99C²。实验数据显示，提纯出的硫酸软骨素占总原料的45.82%，并对提纯出的物质进行红外光谱分析，最终确定提取物质为硫酸软骨素。

关键词：鲟鱼软骨；硫酸软骨素；提取工艺；结构表征

Abstract

The chondroitin sulfate was extracted by using the method of dilute alkali and enzymolysis. In the dilute alkali on the basis of alkali extraction, papain, trypsin enzyme decomposition to remove the protein, after ethanol precipitation and drying to get the product. Firstly, the range of each factor was determined by single factor experiment. Then, the quadratic polynomial model was established by Box-Behnken center combination experiment design, and the response surface analysis was carried out. The optimum extraction process is as follows: the ratio of material to liquid is 1: 7, the concentration of alkali is 4%, the temperature is 37℃, the extraction time is 3h.The partial regression equation of alkali extraction is Y₁=40.54-2.31A 1.33B 1.31C 1.25D-2.71AB 1.11AC 2.79AD 5.65BC 0.17BD 2.85CD-0.38A² 4.89B²-2.03C²-1.77D².The optimum extraction process was as follows: the dosage of papain and trypsin was 2%, the enzyme extraction temperature was 31℃, and the enzyme extraction time was 3h. The partial regression equation of enzyme extraction was Y₂=43.6-0.98A-0.49B 1.36C 0.4AB-0.9AC-1.02BC 0.038A²-1.09B²-1.99C²

The results were significant, the yield of chondroitin sulfate was 45.82%, and the extracted material was chondroitin sulfate by infrared spectroscopy.

Key words: sturgeon cartilage; chondroitin sulfate; extraction process; structural characterization

目 录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

1.1 硫酸软骨素的概述 1

1.1.1 硫酸软骨素的分布状况、化学结构及性质 1

1.1.2 硫酸软骨素的原料来源 2

1.1.3 硫酸软骨素的药理作用 3

1.1.4 硫酸软骨素的应用 4

1.2 硫酸软骨素的提取技术进展 5

1.2.1 碱法 6

1.2.2 稀碱-盐 6

1.2.3 酶法 6

1.2.4 超声波提取法 7

1.2.5 乙酸抽提法 7

1.3 研究目的与意义 7

第2章 硫酸软骨素碱提取部分工艺研究 8

2.1 原料与试剂 8

2.2 仪器与设备 8

2.3 实验方法 8

2.3.1硫酸软骨素的提取方法 8

2.3.2 硫酸软骨素的纯化方法 9

2.3.3 硫酸软骨素碱提取部分单因素实验 9

2.3.3.1 料液比对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 9

2.3.3.2 碱液浓度对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 9

2.3.3.3 提取温度对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 9

2.3.3.4 提取时间对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 9

2.3.4 硫酸软骨素碱提取部分响应面法优化 9

2.4结果与讨论 10

2.4.1 硫酸软骨素碱提取部分单因素实验结果 10

2.4.1.1 料液比对硫酸软骨素提取率的影响 10

2.4.1.2碱液浓度对硫酸软骨素提取率的影响 10

2.4.1.3 提取温度对硫酸软骨素提取率的影响 11

2.4.1.4 提取时间对硫酸软骨素提取率的影响 12

2.4.2 硫酸软骨素碱提取部分响应面法优化结果 12

2.5 本章小结 16

第3章 硫酸软骨素酶提取部分工艺研究 17

3.1 原料与试剂 17

3.2 仪器与设备 17

3.3 实验方法 18

3.3.1 硫酸软骨素酶提取部分单因素实验 18

3.3.1.1 酶添加量对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 18

3.3.1.2 酶解温度对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 18

3.3.1.3 酶解时间对硫酸软骨素提取率影响的单因素实验 18

3.3.2 硫酸软骨素酶提取部分响应面法优化 18

3.3.3 硫酸软骨素产品结构表征 18

3.3.3.1硫酸软骨素红外光谱测试 18

3.4 结果与讨论 19

3.4.1 硫酸软骨素酶提取部分单因素实验结果 19

3.4.1.1 酶添加量对硫酸软骨素提取率的影响 19

3.4.1.3 酶解时间对硫酸软骨素提取率的影响 20

3.4.2 硫酸软骨素酶提取部分响应面法实验结果 21

3.4.3 硫酸软骨素产品结构表征结果 24

3.4.3.1 硫酸软骨素红外光谱 24

3.5 本章小结 25

结论与展望 26

参考文献 27

致 谢 29

第1章 绪论

1.1 硫酸软骨素的概述

早在2亿3千万年前的早三叠纪时期，鲟类就已经开始出现在地球上了，同大熊猫等珍稀类动物一样，它们都具有十分重要历史价值和学术价值，是研究鱼类和脊椎动物演化与生物进化的活化石，而且随着技术的发展，这些动物开始具有重要的经济价值，近年来，随着鲟鱼养殖技术的完善，我国的鲟鱼养殖业已形成较大规模，现已成为世界第一鲟养殖大国^[1]。然而，含有大量硫酸软骨素但被淘汰为固体废物的中国鲟鱼软骨仍具潜在的巨大的市场价值。而且，科学研究表明，从动物软骨中提取出的硫酸软骨素可以提取出具有一定保健作用和很高营养价值的黏性多糖，对保健品、化妆品和药品以及食品产业具有十分重大的意义和经济价值，具有很好的市场前景。所以对于鲟鱼硫酸软骨素的提取研究和工艺优化有重大意义。

1.1.1 硫酸软骨素的分布状况、化学结构及性质

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)也叫牛黄软骨素、康得宁等，多发现于哺乳类动物结缔组织中，像软骨、鼻骨、喉骨、韧带、肌膜都含有丰富的硫酸软骨素^[2]。同时在一些鱼类软骨中也被发现有大量的硫酸软骨素，比如鲨鱼软骨中的硫酸软骨素就高达50%~60%，但结缔组织的总量很少。空腔动物、软体动物以及原生动物也含有，目前植物中还没有发现这一物质的存在^[3]。软骨中的硫酸软骨素通常是以与蛋白质结合形成蛋白多糖的形式存在，是一种属于糖氨聚糖类物质的酸性粘多糖。硫酸软骨素的形成和结构十分复杂，通常，是由50到70个由β-l，4-糖苷键连接的D-氨基葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖构成的二糖通过硫酸基团与N-乙酰-D-氨基半乳糖碳四位或六位上氢氧基的聚合反应生成的多糖大分子^[4]，它的分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₄S)n，分子量大小在10000到50000之间，又因为分子中存在大量的羧基、硫酸基团，且由于位置和分子结构的不同，有多种同分异构体存在^[5]。由机体组织自然产生的硫酸软骨素通常与蛋白质化合并以糖蛋白的形式分布于动物的软骨组织中，在动物的肌腱、心脏、角膜、嗜碱细胞中都分布有这种物质^[6]。