摘 要

该研究收集三尖杉属植物三尖杉、粗榧和蓖子三尖杉3种及混伪品南方红豆杉、巴山冷杉2种，共19份样品，通过DNA提取和PCR扩增，经注释后获得其ITS2条形码，用CodonCode Aligner将所得序列进行拼接剪切，然后使用MEGA5.1 软件进行序列对比分析，计算其种内及种间遗传距离（K2P），构建邻接树（neighbor-joing Tree , NJ Tree），进行序列变异分析和NJ树聚类分析，探讨三尖杉属药材鉴定新方法。结果表明三尖杉种内K2P最大距离小于其种间K2P距离，NJ聚类树显示三尖杉属植物与其混伪品聚在独立的支。因此，ITS2作为DNA条形码可以鉴定三尖杉属药用植物及其混伪品，DNA条形码技术可以是三尖杉属药用植物及其混伪品的鉴定的新方法。

关键词：三尖杉属；ITS2；DNA条形码；鉴定；

Abstract

The study collected Cephalotaxus three kinds and adulterants two kinds, a total of 19 samples by DNA extraction and PCR amplification was obtained by its barcode ITS2 after the comment, and then using CodonCode Aligner amplify and seguence the ITS2 regions. The genetic distances were computed using MEGA5.1 in accordance with thekimura 2-parameter (K2P) model and the neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed. the sequence variation analysis and cluster analysis NJ tree.The results indicated that the maximum distance K2P Cephalotaxus species less than K2P distance between their species. In NJ clustering tree Cephalotaxus and its adulterants were independent branch.Therefore, ITS2 DNA barcoding can identify Cephalotaxus from its adulterants, DNA barcoding technique can be a new method to identify Cephalotaxus medicinal materials.

Keywords: Cephalotaxus Sieb. et Zucc. ex Endl. ; ITS2; DNA barcode; Identification

目 录

第1章 绪论 1

1.1 药材简介 1

1.1.1 三尖杉属简介 1

1.1.2 粗榧药材简介 1

1.1.3 三尖杉药材简介 1

1.1.4 蓖子三尖杉药材简介 2

1.2 研究目的及意义 2

1.3 DNA条形码技术 3

1.3.1 DNA条形码技术的概念 3

1.3.2 DNA条形码技术的发展及优势 3

1.3.3 DNA条形码技术的国内外研究现状 3

1.4 研究内容及目标 4

1.4.1 研究内容 4

1.4.2 目标 4

第2章 药材的DNA条形码实验鉴定研究 5

2.1 实验原理 5

2.1.1 总DNA的提取 5

2.1.2 DNA检测 5

2.1.3 PCR原理 6

2.1.4 测序原理 6

2.2 实验耗材 6

2.2.1 实验药品及来源 6

2.2.2 仪器与试剂 8

2.3 实验方法 9

2.3.1 供试品处理 9

2.3.2 药品的配置 10

2.3.3 DNA的提取 10

2.3.4 样品DNA的保存 12

2.3.5 PCR扩增 12

2.3.6 琼脂糖凝胶电泳检测 12

2.3.7 测序 13

2.3.8 数据分析 13

2.4 数据分析及处理 13

2.4.1 三尖杉属及其混伪品种内序列特征分析 13

2.4.2 三尖杉属与混伪品种间变异分析 15

2.4.3三尖杉属与混伪品种间序列聚类分析 15

第3章 结论 17

参考文献 18

致谢 19

1. 绪论

1.1 药材简介

1.1.1 三尖杉属简介

三尖杉属（学名：Cephalotaxus Sieb. et Zucc. ex Endl.）是三尖杉科下的一个属，为常绿乔木或灌木，叶线形或线状披针形，交互对生或近对生，在侧枝上基部扭转而排成2列，背面有白粉带2条，中脉上面凸起；髓心中部具树脂道；小枝对生或不对生，基部具宿存芽鳞。叶条形或披针状条形，稀披针形，交叉对生或近对生，在侧枝上基部扭转排列成两列，上面中脉隆起，下面有两条宽气孔带，在横切面上维管束的下方有一树脂道。球花单性，雌雄异株，稀同株；雄球花6-11聚生成头状花序，单生叶腋，有梗或几无梗，基部有多数螺旋状着生的苞片，每一雄球花的基部有一枚卵形或三角状卵形的苞片，雄蕊4-16枚，各具2-4（多为3)个背腹面排列的花药，花丝短，药隔三角形，药室纵裂，花粉无气囊；雌球花具长梗，生于小枝基部（稀近枝顶）苞片的腋部，花梗上部的花轴上具数对交叉对生的苞片，每一苞片的腋部有两枚直立胚珠，胚珠生于珠托之上。种子第二年成熟，核果状，全部包于由珠托发育成的肉质假种皮中，常数个（稀1个）生于轴上，卵圆形、椭圆状卵圆形或圆球形，顶端具突起的小尖头，基部有宿存的苞片，外种皮质硬，内种皮薄膜质，有胚乳；子叶2枚，发芽时出土。三尖杉属共有9种。中国有三尖杉C. fortunei Hook. f. 和粗榧C. sinensis（Rehd. et Wils. ）Li等7种，产秦岭及黄河以南各省区。

1.1.2 粗榧药材简介

粗榧（Cephalotaxus sinensis (Rehd. et Wils. ) Li）为灌木，大约2-5米高，间或长成高达15米的小乔木；树皮灰色或灰褐色，分裂成薄片脱落。叶条形，排列成两列，通常直，稀微弯，长2-5厘米，宽约3毫米，基部近圆形，几无柄，上部通常与中下部等宽或微窄，先端通常渐尖或微凸尖，稀凸尖，上面深绿色，中脉明显，下面有2条白色气孔带，较绿色边带宽2-4倍。雄球花6-7聚生成头状，径约6毫米，总梗长约3毫米，基部及总梗上有多数苞片，雄球花卵圆形，基部有1枚苞片，雄蕊4-11枚，花丝短，花药2-4（多为3）个。种子通常2-5个着生于轴上，卵圆形、椭圆状卵形或近球形，很少成倒卵状椭圆形，长1.8-2.5厘米，顶端中央有一小尖头。花期3-4月，种子8-10月成熟。

1.1.3 三尖杉药材简介